Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje rezultate preporučujemo da koristite noviju verziju preglednika (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazujemo stranicu bez stiliziranja ili JavaScripta.
Rast mikroba u ranama često se manifestira kao biofilmovi koji ometaju zacjeljivanje i teško ih je iskorijeniti. Novi srebrni zavoji tvrde da se bore protiv infekcija rana, ali njihova učinkovitost u borbi protiv biofilma i učinci zacjeljivanja neovisni o infekciji općenito su nepoznati. Koristeći in vitro i in vivo modele biofilma Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa, izvještavamo o učinkovitosti zavoja koji generiraju Ag1+ ione; Ag1+ zavoja koji sadrže etilendiamintetraoctenu kiselinu i benzetonijev klorid (Ag1+/EDTA/BC) te zavoja koji sadrže srebrov nitrat (Ag oksisoli), koji proizvode Ag1+, Ag2+ i Ag3+ ione za borbu protiv biofilma rane i njegovog utjecaja na zacjeljivanje. Ag1+ zavoji imali su minimalne učinke na biofilm rane in vitro i kod miševa (C57BL/6j). Nasuprot tome, oksigenirane Ag soli i Ag1+/EDTA/BC zavoji značajno su smanjili broj održivih bakterija u biofilmovima in vitro i pokazali značajno smanjenje bakterijskih i EPS komponenti u biofilmovima mišjih rana. Ovi su zavoji imali različite učinke na zacjeljivanje rana inficiranih biofilmom i onih koje nisu inficirane biofilmom, pri čemu su zavoji s oksigeniranom soli imali povoljnije učinke na reepitelizaciju, veličinu rane i upalu u usporedbi s kontrolnim tretmanima i drugim zavojima sa srebrom. Različita fizikalno-kemijska svojstva zavoja sa srebrom mogu imati različite učinke na biofilm rane i zacjeljivanje, a to treba uzeti u obzir pri odabiru zavoja za liječenje rana inficiranih biofilmom.
Kronične rane definirane su kao „rane koje ne prolaze kroz normalne faze zacjeljivanja na uredan i pravovremen način“1. Kronične rane stvaraju psihološki, socijalni i ekonomski teret za pacijente i zdravstveni sustav. Godišnja potrošnja NHS-a na liječenje rana i povezanih komorbiditeta procjenjuje se na 8,3 milijarde funti u razdoblju 2017. – 2018.2. Kronične rane također su trenutno gorući problem u Sjedinjenim Državama, a Medicare procjenjuje godišnje troškove liječenja pacijenata s ranama na 28,1–96,8 milijardi dolara3.
Infekcija je glavni čimbenik koji sprječava zacjeljivanje rana. Infekcije se često manifestiraju kao biofilmovi, koji su prisutni u 78% kroničnih rana koje ne zacjeljuju. Biofilmovi nastaju kada se mikroorganizmi nepovratno vežu za površine, poput površina rana, i mogu se agregirati i formirati zajednice koje proizvode izvanstanične polimere (EPS). Biofilm rane povezan je s povećanim upalnim odgovorom koji dovodi do oštećenja tkiva, što može odgoditi ili spriječiti zacjeljivanje4. Povećanje oštećenja tkiva može biti djelomično posljedica povećane aktivnosti matričnih metaloproteinaza, kolagenaze, elastaze i reaktivnih vrsta kisika5. Štoviše, upalne stanice i biofilmovi sami su veliki potrošači kisika i stoga mogu uzrokovati lokalnu hipoksiju tkiva, iscrpljujući stanice vitalnim kisikom potrebnim za učinkovit popravak tkiva6.
Zreli biofilmovi su vrlo otporni na antimikrobna sredstva, što zahtijeva agresivne strategije za kontrolu infekcija biofilma, poput mehaničkog tretmana nakon kojeg slijedi učinkovit antimikrobni tretman. Budući da se biofilmovi mogu brzo regenerirati, učinkoviti antimikrobni lijekovi mogu smanjiti rizik od ponovnog stvaranja nakon kirurškog debridementa7.
Srebro se sve više koristi u antimikrobnim zavojima i često se koristi kao prva linija liječenja kronično inficiranih rana. Postoje mnogi komercijalno dostupni srebrni zavoji, od kojih svaki sadrži drugačiji sastav, koncentraciju i osnovnu matricu srebra. Napredak u srebrnim zavojima doveo je do razvoja novih srebrnih zavoja. Metalni oblik srebra (Ag0) je inertan; da bi se postigla antimikrobna učinkovitost, mora izgubiti elektron da bi se formiralo ionsko srebro (Ag1+). Tradicionalni srebrni zavoji sadrže spojeve srebra ili metalno srebro koji se, kada su izloženi tekućini, razgrađuju i formiraju Ag1+ ione. Ovi Ag1+ ioni reagiraju s bakterijskom stanicom, uklanjajući elektrone iz strukturnih komponenti ili kritičnih procesa potrebnih za preživljavanje. Patentirana tehnologija dovela je do razvoja novog spoja srebra, Ag oksisoli (srebrov nitrat, Ag7NO11), koji se uključuje u zavoje za rane. Za razliku od tradicionalnog srebra, razgradnja soli koje sadrže kisik stvara stanja srebra s višom valencijom (Ag1+, Ag2+ i Ag3+). Studije in vitro pokazale su da su niske koncentracije oksigeniranih srebrnih soli učinkovitije od jednoionskog srebra (Ag1+) protiv patogenih bakterija poput Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i Escherichia coli8,9. Druga nova vrsta srebrnog zavoja uključuje dodatne sastojke, naime etilendiamintetraoctenu kiselinu (EDTA) i benzetonijev klorid (BC), za koje se navodi da ciljaju EPS biofilm i time povećavaju prodiranje srebra u biofilm. Ove nove tehnologije srebra nude nove načine ciljanja biofilmova rana. Međutim, utjecaj ovih antimikrobnih sredstava na okolinu rane i zacjeljivanje neovisno o infekciji važan je kako bi se osiguralo da ne stvaraju nepovoljno okruženje rane ili odgađaju zacjeljivanje. Zabrinutost zbog citotoksičnosti srebra in vitro zabilježena je kod nekoliko srebrnih zavoja10,11. Međutim, citotoksičnost in vitro još se nije prevela u toksičnost in vivo, a nekoliko Ag1+ zavoja pokazalo je dobar sigurnosni profil12.
Ovdje smo istražili učinkovitost karboksimetilceluloznih obloga koje sadrže nove formulacije srebra protiv biofilma rana in vitro i in vivo. Osim toga, procijenjeni su učinci ovih obloga na imunološki odgovor i zacjeljivanje neovisno o infekciji.
Svi korišteni zavoji bili su komercijalno dostupni. 3M Kerracel Gel Fiber Dressing (3M, Knutsford, UK) je neantimikrobni zavoj od 100% karboksimetilceluloznih (CMC) gel vlakana koji je korišten kao kontrolni zavoj u ovoj studiji. Procijenjena su tri antimikrobna CMC srebrna zavoja, i to 3M Kerracel Ag zavoj (3M, Knutsford, UK), koji sadrži 1,7 težinskih % oksigenirane srebrne soli (Ag7NO11) u ionima srebra više valencije (Ag1+, Ag2+ i Ag3+). Tijekom razgradnje Ag7NO11, ioni Ag1+, Ag2+ i Ag3+ nastaju u omjeru 1:2:4. Aquacel Ag Extra oblog koji sadrži 1,2% srebrovog klorida (Ag1+) (ConvaTec, Deeside, UK) 13 i Aquacel Ag + Extra oblog koji sadrži 1,2% srebrovog klorida (Ag1+), EDTA i benzetonijev klorid (ConvaTec, Deeside, UK) 14.
Sojevi korišteni u ovoj studiji bili su Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) i Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Bakterije su uzgajane preko noći u Muller-Hintonovom bujonu (Oxoid, Altrincham, UK). Kultura uzgojena preko noći je zatim razrijeđena 1:100 u Mueller-Hintonovom bujonu i 200 µl nasađeno na sterilne 0,2 µm Whatman cyclopore membrane (Whatman plc, Maidstone, UK) na Mueller-Hinton agar ploče (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Velika Britanija). ) Formiranje kolonijalnog biofilma na 37°C tijekom 24 sata. Ovi kolonijalni biofilmovi testirani su na logaritamsko skupljanje.
Izrežite zavoj na kvadratne komade od 3 cm2 i prethodno navlažite sterilnom deioniziranom vodom. Stavite zavoj preko biofilma kolonije na agar ploči. Svakih 24 ha biofilma je uklonjeno, a žive bakterije unutar biofilma (CFU/ml) kvantificirane su serijskim razrjeđivanjem (10−1 do 10−7) u neutralizacijskom bujonu Day-Angle (Merck-Millipore). Nakon 24 sata inkubacije na 37°C, provedeno je standardno brojanje na pločama na Mueller-Hinton agar pločama. Svaki tretman i vremenska točka provedeni su u tri primjerka, a brojanje na pločama ponovljeno je za svako razrjeđenje.
Koža svinjskog trbuha dobiva se od ženki velikih bijelih svinja unutar 15 minuta od klanja u skladu s izvoznim standardima Europske unije. Koža je obrijana i očišćena alkoholnim maramicama, a zatim zamrznuta na -80°C tijekom 24 sata kako bi se devitalizirala. Nakon odmrzavanja, komadići kože od 1 cm2 oprani su tri puta s PBS-om, 0,6%-tnim natrijevim hipokloritom i 70%-tnim etanolom po 20 minuta svaki put. Prije uklanjanja epiderme, uklonite preostali etanol ispiranjem 3 puta u sterilnom PBS-u. Koža je uzgajana na ploči sa 6 jažica s najlonskom membranom debljine 0,45 μm (Merck-Millipore) na vrhu i 3 upijajuća jastučića (Merck-Millipore) koji sadrže 3 ml fetalnog goveđeg seruma (Sigma) nadopunjenog s 10% Dulbeccovog modificiranog Eagle medija (Dulbecco's Modified Eagle Medium – Aldrich Ltd.).
Kolonijalni biofilmovi uzgojeni su kako je opisano za studije izloženosti biofilmu. Nakon kultiviranja biofilma na membrani tijekom 72 sata, biofilm je nanesen na površinu kože pomoću sterilne inokulacijske petlje, a membrana je uklonjena. Biofilm je zatim inkubiran na dermisu svinje dodatnih 24 sata na 37°C kako bi biofilm sazrio i prianjao na kožu svinje. Nakon što je biofilm sazrio i pričvrstio se, zavoj od 1,5 cm2, prethodno navlažen sterilnom destiliranom vodom, nanesen je izravno na površinu kože i inkubiran na 37°C tijekom 24 sata. Viable bakterije vizualizirane su bojenjem ravnomjernim nanošenjem reagensa za vijabilnost stanica PrestoBlue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, UK) na apikalnu površinu svakog eksplantata i inkubacijom tijekom 5 minuta. Koristite digitalnu kameru Leica DFC425 za trenutno snimanje slika na mikroskopu Leica MZ8. Područja obojena ružičastom bojom kvantificirana su pomoću softvera Image Pro verzije 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (mediacy.com)). Skenirajuća elektronska mikroskopija provedena je kako je opisano u nastavku.
Bakterije uzgojene preko noći razrijeđene su 1:100 u Mueller-Hintonovom bujonu. 200 μl kulture dodano je na sterilnu 0,2 μm Whatman ciklopornu membranu (Whatman, Maidstone, UK) i nasađeno na Mueller-Hinton agar. Ploče s biofilmom inkubirane su na 37°C tijekom 72 sata kako bi se omogućilo stvaranje zrelog biofilma.
Nakon 3 dana sazrijevanja biofilma, kvadratni zavoj od 3 cm2 postavljen je izravno na biofilm i inkubiran na 37°C tijekom 24 sata. Nakon uklanjanja zavoja s površine biofilma, na površinu svakog biofilma dodan je 1 ml PrestoBlue reagensa za vijabilnost stanica (Invitrogen, Waltham, MA) tijekom 20 sekundi. Površine su osušene prije nego što su promjene boje zabilježene digitalnim fotoaparatom Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, UK).
Pripremite kulture preko noći na Mueller-Hinton agaru, prenesite pojedinačne kolonije u 10 ml Mueller-Hinton bujona i inkubirajte na mućkalici na 37°C (100 okretaja u minuti). Nakon inkubacije preko noći, kultura je razrijeđena 1:100 u Mueller-Hinton bujonu i 300 µl je naneseno na kružnu Whatman ciklopornu membranu od 0,2 µm (Whatman International, Maidstone, UK) na Mueller-Hinton agaru i inkubirano na 37°C unutar 72 sata. Zreli biofilm je nanesen na ranu kako je opisano u nastavku.
Sav rad sa životinjama proveden je na Sveučilištu u Manchesteru prema projektnoj licenci koju je odobrio Ured za dobrobit životinja i etičku reviziju (P8721BD27) i u skladu sa smjernicama koje je objavilo Ministarstvo unutarnjih poslova prema revidiranom ASPA-i iz 2012. Svi autori pridržavali su se smjernica za dolazak. Za sve in vivo studije korišteni su osam tjedana stari miševi C57BL/6j (Envigo, Oxon, UK). Miševi su anestezirani izofluranom (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, UK), a njihove dorzalne površine su obrijane i očišćene. Svaki je miš zatim dobio ekscizijsku ranu veličine 2 × 6 mm pomoću Stiefel biopsijskog bušilice (Schuco International, Hertfordshire, UK). Za rane zaražene biofilmom, nanesite 72-satni kolonijalni biofilm uzgojen na membrani kako je gore opisano na dermalni sloj rane pomoću sterilne inokulacijske petlje odmah nakon ozljede i odbacite membranu. Jedan kvadratni centimetar zavoja prethodno je navlažen sterilnom vodom kako bi se održalo vlažno okruženje rane. Zavoji su naneseni izravno na svaku ranu i prekriveni 3M Tegaderm filmom (3M, Bracknell, UK) i tekućim ljepilom Mastisol (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) nanesenim oko rubova radi dodatnog prianjanja. Buprenorfin (Animalcare, York, UK) primijenjen je u koncentraciji od 0,1 mg/kg kao analgetik. Miševi su izlučeni tri dana nakon ozljede korištenjem metode iz Rasporeda 1 te je područje rane uklonjeno, prepolovljeno i pohranjeno po potrebi.
Bojenje hematoksilinom (ThermoFisher Scientific) i eozinom (ThermoFisher Scientific) provedeno je prema protokolu proizvođača. Površina rane i reepitelizacija kvantificirani su pomoću softvera Image Pro verzije 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Presjeci tkiva su deparafinirani u ksilenu (ThermoFisher Scientific, Loughborough, UK), rehidrirani sa 100-50%-tnim etanolom i kratko uronjeni u deioniziranu vodu (ThermoFisher Scientific). Imunohistokemija je provedena korištenjem VectaStain Elite ABC PK-6104 kita (Vector Laboratories, Burlingame, CA) prema protokolu proizvođača. Primarna antitijela na neutrofile NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) i makrofage Ms CD107b Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, UK) razrijeđena su 1:100 u otopini za blokiranje i dodana na površinu reza, nakon čega su dodana 2 antitijela Anti-, VectaStain ABC i Vector Nova Red Peroxidase (HRP) supstratni kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) te kontrastno obojena hematoksilinom. Slike su snimljene mikroskopom Olympus BX43 i digitalnim fotoaparatom Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, UK).
Uzorci kože fiksirani su u 2,5%-tnom glutaraldehidu i 4%-tnom formaldehidu u 0,1 M HEPES-u (pH 7,4) tijekom 24 sata na 4°C. Uzorci su dehidrirani pomoću graduiranog etanola i sušeni u CO2 pomoću sušilice kritičnih točaka Quorum K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, UK) te presvučeni legurom zlata i paladija raspršivanjem pomoću mini sustava za raspršivanje/tijenjeno izbijanje Quorum SC7620. Uzorci su snimljeni pomoću skenirajućeg elektronskog mikroskopa FEI Quanta 250 (ThermoFisher Scientific) kako bi se vizualizirala središnja točka rane.
Toto-1 jodid (2 μM) nanesen je na izrezanu površinu mišje rane i inkubiran 5 minuta na 37 °C (ThermoFisher Scientific) te tretiran sa Syto-60 (10 μM) na 37 °C (ThermoFisher Scientific). 15-minutne Z-stack slike stvorene su pomoću Leica TCS SP8.
Biološki i tehnički podaci o ponavljanjima tabelarno su prikazani i analizirani pomoću softvera Graphpad Prism V9 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Jednosmjerna analiza varijance s višestrukim usporedbama korištenjem Dunnettovog post hoc testa korištena je za testiranje razlika između svakog tretmana i kontrolnog zavoja bez antimikrobnih tvari. Vrijednost p <0,05 smatrana je značajnom.
Učinkovitost vlaknastih obloga od srebrnog gela prvo je procijenjena na kolonijama biofilma Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa in vitro. Srebrni oblogi sadrže različite formule srebra: tradicionalni srebrni oblogi proizvode Ag1+ ione; srebrni oblogi, koji mogu proizvesti Ag1+ ione nakon dodavanja EDTA/BC, mogu uništiti matricu biofilma i izložiti bakterije srebru pod antibakterijskim učinkom srebrnih iona15 i obloge koje sadrže oksigenirane soli Ag koje proizvode Ag1+, Ag2+ i Ag3+ ione. Njegova učinkovitost uspoređena je s kontrolnim oblogom bez antimikrobnog djelovanja napravljenim od geliranih vlakana. Preostale održive bakterije unutar biofilma procijenjivane su svakih 24 sata tijekom 8 dana (Slika 1). 5. dana biofilm je ponovno inokuliran s 3,85 × 105S Staphylococcus aureus ili 1,22 × 105P. aeruginosa kako bi se procijenio oporavak biofilma. U usporedbi s kontrolnim zavojima bez antimikrobnih tvari, zavoji s Ag1+ imali su minimalan učinak na bakterijsku održivost u biofilmovima Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa tijekom 5 dana. Nasuprot tome, zavoji koji sadrže oksigenirani Ag i Ag1+ + EDTA/BC soli bili su učinkoviti u ubijanju bakterija unutar biofilma unutar 5 dana. Nakon ponovljene inokulacije planktonskim bakterijama 5. dana nije uočena obnova biofilma (slika 1).
Kvantifikacija održivih bakterija u biofilmovima Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa nakon tretmana srebrnim oblogama. Kolonije biofilma Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa tretirane su srebrnim oblogama ili kontrolnim oblogama bez antimikrobnih tvari, a broj preostalih održivih bakterija određivan je svakih 24 sata. Nakon 5 dana, biofilm je ponovno inokuliran s 3,85 × 105S. Staphylococcus aureus ili 1,22 × 105P. Kolonije bakterioplanktona Pseudomonas aeruginosa formirane su pojedinačno kako bi se procijenio oporavak biofilma. Grafovi prikazuju srednju vrijednost +/- standardnu pogrešku.
Kako bi se vizualizirao učinak srebrnih obloga na održivost biofilma, obloge su nanesene na zrele biofilmove uzgojene na koži svinje ex vivo. Nakon 24 sata, obloga se uklanja, a biofilm se boji plavom reaktivnom bojom, koju žive bakterije metaboliziraju u ružičastu boju. Biofilmovi tretirani kontrolnim oblogama bili su ružičasti, što ukazuje na prisutnost održivih bakterija unutar biofilma (Slika 2A). Nasuprot tome, biofilm tretiran oblogom Ag oxysols bio je prvenstveno plav, što ukazuje na to da su preostale bakterije na površini kože svinje bile neodržive bakterije (Slika 2B). Mješovita plava i ružičasta obojenost uočena je u biofilmovima tretiranim oblogama koje sadrže Ag1+, što ukazuje na prisutnost održivih i neodrživih bakterija unutar biofilma (Slika 2C), dok su obloge EDTA/BC koje sadrže Ag1+ bile pretežno plave s nekim ružičastim mrljama, što ukazuje na područja koja nisu zahvaćena srebrnim oblogom (Slika 2D). Kvantifikacija aktivnih (ružičastih) i neaktivnih (plavih) područja pokazala je da je kontrolni flaster bio 75% aktivan (Slika 2E). Ag1+ + EDTA/BC obloge djelovale su slično kao i obloge s oksigeniranim Ag solima, sa stopama preživljavanja od 13% odnosno 14%. Ag1+ obloga također je smanjila bakterijsku održivost za 21%. Ti biofilmovi su zatim promatrani skenirajućom elektronskom mikroskopijom (SEM). Nakon tretmana kontrolnim oblogom i Ag1+ oblogom, uočen je sloj Pseudomonas aeruginosa koji je prekrivao kožu svinje (Slika 2F,H), dok je nakon tretmana Ag1+ oblogom pronađeno malo bakterijskih stanica i malo bakterijskih stanica ispod njih. Kolagena vlakna mogu se smatrati tkivnom strukturom kože svinje (Slika 2G). Nakon tretmana Ag1+ + EDTA/BC oblogom, vidljive su bakterijske ploče i podložne ploče kolagenih vlakana (Slika 2I).
Vizualizacija biofilma Pseudomonas aeruginosa nakon tretmana srebrnim oblogom. (A–D) Bakterijska održivost u biofilmovima Pseudomonas aeruginosa uzgojenim na koži svinje vizualizirana je pomoću boje za održivost PrestoBlue 24 sata nakon tretmana srebrnim oblogama ili kontrolnim oblogama bez antimikrobnih sastojaka. Žive bakterije su ružičaste, neodržive bakterije i koža svinje su plave. (E) Kvantifikacija biofilmova Pseudomonas aeruginosa uzgojenih na koži svinje (ružičasta mrlja) pomoću skenirajuće elektronske mikroskopije Image Pro verzije 10 (FI) i tretiranih srebrnim oblogom ili kontrolnim oblogom bez antimikrobnih sastojaka tijekom 24 sata. SEM skala = 5 µm. (J–M) Kolonijalistički biofilmovi rasli su na filterima i obojeni su reaktivnom bojom PrestoBlue nakon 24 sata inkubacije sa srebrnim oblogama.
Kako bi se utvrdilo utječe li bliski kontakt između zavoja i biofilmova na učinkovitost zavoja, kolonijalni biofilmovi postavljeni na ravnu površinu tretirani su zavojima 24 sata, a zatim obojeni reaktivnim bojama. Neobrađeni biofilm bio je tamno ružičaste boje (Slika 2J). Za razliku od biofilmova tretiranih zavojima koji sadrže oksigenirane Ag soli (Slika 2K), biofilmovi tretirani zavojima koji sadrže Ag1+ ili Ag1+ + EDTA/BC pokazali su trake ružičastog bojenja (Slika 2L,M). Ova ružičasta obojenost ukazuje na prisutnost održivih bakterija i povezana je s područjem šava unutar zavoja. Ova ušivena područja stvaraju mrtve prostore koji omogućuju bakterijama unutar biofilma preživljavanje.
Kako bi se procijenila učinkovitost srebrnih obloga in vivo, rane miševa zaraženih zrelim biofilmovima S. aureus i P. aeruginosa, kojima je u potpunosti izrezana rana, tretirane su kontrolnim oblogama bez antimikrobnih sastojaka ili srebrnim oblogama. Nakon 3 dana liječenja, makroskopska analiza slike pokazala je manje veličine rana kada su tretirane oblogama s oksigeniranom soli u usporedbi s kontrolnim oblogama bez antimikrobnih sastojaka i drugim srebrnim oblogama (slika 3A-H). Kako bi se potvrdila ova zapažanja, rane su sakupljene, a površina rane i reepitelizacija kvantificirani su na presjecima tkiva obojenim hematoksilinom i eozinom pomoću softvera Image Pro verzije 10 (slika 3I-L).
Učinak srebrnih obloga na površinu rane i reepitelizacija rana zaraženih biofilmovima. (A–H) Male stanice zaražene biofilmovima Pseudomonas aeruginosa (A–D) i Staphylococcus aureus (E–H) nakon tri dana liječenja kontrolnim oblogom bez antimikrobnog djelovanja, oblogom s oksigeniranom Ag soli, oblogom s Ag1+ i oblogom s Ag1+. Reprezentativne makroskopske slike. Rane miševa s oblogom Ag1+ + EDTA/BC. (IL) Reprezentativna infekcija Pseudomonas aeruginosa, histološki presjeci obojeni hematoksilinom i eozinom, korišteni za kvantificiranje površine rane i regeneracije epitela. Kvantifikacija površine rane (M, O) i postotka reepitelizacije (N, P) rana zaraženih biofilmovima Pseudomonas aeruginosa (M, N) i Staphylococcus aureus (O, P) (po skupini liječenja n = 12). Grafovi prikazuju srednju vrijednost +/- standardnu pogrešku. * znači p = < 0,05 ** znači p = < 0,01; Makroskopska skala = 2,5 mm, histološka skala = 500 µm.
Kvantifikacija površine rane kod rana zaraženih biofilmom Pseudomonas aeruginosa (Slika 3M) pokazala je da su rane tretirane Ag oksisolima imale prosječnu veličinu rane od 2,5 mm2, dok je kontrolni zavoj bez antimikrobnih tvari imao prosječnu veličinu rane od 3,1 mm2, što nije točno. dostigla je statističku značajnost (Slika 3M). p = 0,423). Rane tretirane s Ag1+ ili Ag1+ + EDTA/BC nisu pokazale smanjenje površine rane (3,1 mm2 odnosno 3,6 mm2). Liječenje zavojem s oksigeniranom Ag soli potaknulo je reepitelizaciju u većoj mjeri nego kontrolni zavoj bez antimikrobnih tvari (34% odnosno 15%; p = 0,029) i Ag1+ ili Ag1+ + EDTA/BC (10% odnosno 11%) (Slika 3N). . , respektivno).
Slični trendovi u površini rane i regeneraciji epitela uočeni su kod rana zaraženih biofilmovima S. aureus (Slika 3O). Zavoji koji sadrže oksigenirane srebrne soli smanjili su površinu rane (2,0 mm2) za 23% u usporedbi s kontrolnim neantimikrobnim zavojem (2,6 mm2), iako to smanjenje nije bilo značajno (p = 0,304) (Slika 3O). Osim toga, površina rane u skupini tretiranoj Ag1+ bila je neznatno smanjena (2,4 mm2), dok rana tretirana Ag1+ + EDTA/BC zavojem nije smanjila površinu rane (2,9 mm2). Kisikove soli Ag također su u većoj mjeri potaknule ponovnu epitelizaciju rana zaraženih biofilmom S. aureus (31%) nego one tretirane kontrolnim zavojima bez antimikrobnih tvari (12%, p = 0,003) (Slika 3P). Ag1+ oblog (16%, p = 0,903) i Ag+1 + EDTA/BC oblog (14%, p = 0,965) pokazali su razinu regeneracije epitela sličnu kontrolnoj skupini.
Kako bi se vizualizirao učinak srebrnih obloga na matricu biofilma, provedeno je bojenje Toto 1 i Syto 60 jodidom (slika 4). Toto 1 jodid je stanično nepropusna boja koja se može koristiti za točnu vizualizaciju izvanstaničnih nukleinskih kiselina, koje su obilne u EPS-u biofilmova. Syto 60 je stanično propusna boja koja se koristi kao kontrastna boja16. Promatranja Toto 1 i Syto 60 jodida u ranama inokuliranim biofilmovima Pseudomonas aeruginosa (slika 4A-D) i Staphylococcus aureus (slika 4I-L) pokazala su da je nakon 3 dana tretmana oblogom EPS u biofilmu značajno smanjen. Obloge koje sadrže oksigenirane soli Ag i Ag1+ + EDTA/BC. Ag1+ obloge bez dodatnih antibiotičkih komponenti biofilma značajno su smanjile DNA bez stanica u ranama inokuliranim s Pseudomonas aeruginosa, ali su bile manje učinkovite u ranama inokuliranim sa Staphylococcus aureus.
In vivo snimanje biofilma rane nakon 3 dana liječenja kontrolnim ili srebrnim zavojima. Konfokalne slike Pseudomonas aeruginosa (A–D) i Staphylococcus aureus (I–L) obojenih s Toto 1 (zeleno) za vizualizaciju izvanstaničnih nukleinskih kiselina, komponente izvanstaničnih polimera biofilma. Za bojenje unutarstaničnih nukleinskih kiselina koristite Syto 60 (crveno). kiseline. P. Skenirajuća elektronska mikroskopija rana zaraženih biofilmovima Pseudomonas aeruginosa (E–H) i Staphylococcus aureus (M–P) nakon 3 dana liječenja kontrolnim i srebrnim zavojima. SEM skala = 5 µm. Konfokalna skala snimanja = 50 µm.
Skenirajuća elektronska mikroskopija pokazala je da su miševi inokulirani kolonijama biofilma Pseudomonas aeruginosa (slika 4E-H) i Staphylococcus aureus (slika 4M-P) imali značajno manje bakterija u ranama nakon 3 dana liječenja svim srebrnim oblogama.
Kako bi se procijenio učinak srebrnih obloga na upalu rana kod miševa zaraženih biofilmom, dijelovi rana zaraženih biofilmom tretiranih kontrolnim ili srebrnim oblogama tijekom 3 dana imunohistokemijski su obojeni korištenjem antitijela specifičnih za neutrofile i makrofage. Kvantitativno određivanje neutrofila i makrofaga iznutra. granulacijsko tkivo. Slika 5). Svi srebrni oblogi smanjili su broj neutrofila i makrofaga u ranama zaraženim Pseudomonas aeruginosa u usporedbi s kontrolnim oblogama bez antimikrobnih sredstava nakon tri dana liječenja. Međutim, liječenje oblogom s oksigeniranom srebrnom soli rezultiralo je većim smanjenjem neutrofila (p = <0,0001) i makrofaga (p = <0,0001) u usporedbi s drugim testiranim srebrnim oblogama (Slika 5I,J). Iako je Ag1+ + EDTA/BC imao veći učinak na biofilm rane, smanjio je razinu neutrofila i makrofaga u manjoj mjeri od obloge Ag1+. Umjerene rane inficirane biofilmom S. aureus također su uočene nakon previjanja s Ag (p = <0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) i Ag1++ EDTA/BC (p = 0,0043) oksisolima u usporedbi s kontrolnom skupinom. Slični trendovi uočeni su i za neutropeniju. (Slika 5K). Međutim, samo je preljev s oksigeniranom Ag soli pokazao značajno smanjenje broja makrofaga u granulacijskom tkivu u usporedbi s kontrolnom skupinom kod rana inficiranih biofilmovima S. aureus (p = 0,0339) (Slika 5L).
Neutrofili i makrofagi kvantificirani su u ranama zaraženim biofilmovima Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus nakon 3 dana liječenja kontrolnim zavojima bez antimikrobnih sredstava ili srebrnim zavojima. Neutrofili (AD) i makrofagi (EH) kvantificirani su u presjecima tkiva obojenim antitijelima specifičnim za neutrofile ili makrofage. Kvantifikacija neutrofila (I i K) i makrofaga (J i L) u ranama zaraženim biofilmovima Pseudomonas aeruginosa (I i J) i Staphylococcus aureus (K i L). N = 12 po skupini. Grafovi prikazuju srednju vrijednost +/- standardnu pogrešku, vrijednosti značajnosti u usporedbi s kontrolnim zavojem bez antibakterijskih sredstava, * znači p = < 0,05, ** znači p = < 0,01; *** znači p = < 0,001; označava p = < 0,0001).
Zatim smo procijenili učinak srebrnih obloga na zacjeljivanje neovisno o infekciji. Neinficirane ekscizijske rane tretirane su kontrolnim oblogom bez antimikrobnog djelovanja ili oblogom sa srebrom tijekom 3 dana (Slika 6). Među testiranim srebrnim oblogama, samo su rane tretirane oblogom s oksigeniranom soli izgledale manje na makroskopskim slikama od rana tretiranih kontrolnom skupinom (Slika 6A-D). Kvantifikacija površine rane histološkom analizom pokazala je da je prosječna površina rane nakon tretmana oblogom Ag oxysols bila 2,35 mm2 u usporedbi s 2,96 mm2 za rane tretirane kontrolnom skupinom, ali ta razlika nije dosegla statističku značajnost (p = 0,488) (Slika 6I). Nasuprot tome, nije uočeno smanjenje površine rane nakon tretmana oblogama Ag1+ (3,38 mm2, p = 0,757) ili Ag1+ + EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) u usporedbi s kontrolnom skupinom. Povećana regeneracija epitela uočena je s Ag oxysol oblogom u usporedbi s kontrolnom skupinom (30% prema 22%), iako to nije doseglo statističku značajnost (p = 0,067), što je prilično značajno i potvrđuje prethodne rezultate. Obloga s oxysolima potiče ponovnu epitelizaciju. -Epitelizacija neinficiranih rana17. Nasuprot tome, liječenje Ag1+ ili Ag1+ + EDTA/BC oblogama nije imalo učinka ili je pokazalo smanjenu ponovnu epitelizaciju u usporedbi s kontrolnom skupinom.
Učinak srebrnog zavoja za rane na zacjeljivanje rana kod neinficiranih miševa s potpunom resekcijom. (AD) Reprezentativne makroskopske slike rana nakon tri dana liječenja kontrolnim zavojem bez antimikrobnih tvari i srebrnim zavojem. (EH) Reprezentativni presjeci rana obojeni hematoksilinom i eozinom. Kvantifikacija površine rane (I) i postotak reepitelizacije (J) izračunati su iz histoloških presjeka na sredini rane pomoću softvera za analizu slika (n = 11–12 po skupini liječenja). Grafovi prikazuju srednju vrijednost +/- standardnu pogrešku. * znači p = <0,05.
Srebro ima dugu povijest upotrebe kao antimikrobna terapija u zacjeljivanju rana, ali mnoge različite formulacije i metode isporuke mogu rezultirati razlikama u antimikrobnoj učinkovitosti 18. Štoviše, svojstva specifičnih sustava za isporuku srebra kao biofilma nisu u potpunosti shvaćena. Iako je imunološki odgovor domaćina relativno učinkovit protiv planktonskih bakterija, općenito je manje učinkovit protiv biofilmova 19. Planktonske bakterije makrofagi lako fagocitiraju, ali unutar biofilmova, agregirane stanice predstavljaju dodatne probleme ograničavajući odgovor domaćina do te mjere da imunološke stanice mogu proći kroz apoptozu i osloboditi proinflamatorne čimbenike kako bi pojačale imunološki odgovor 20. Uočeno je da neki leukociti mogu prodrijeti u biofilmove 21, ali nisu u stanju fagocitirati bakterije nakon što je ta obrana ugrožena 22. Treba koristiti holistički pristup kako bi se podržao imunološki odgovor domaćina protiv infekcije biofilma rane. Debridement rane može fizički poremetiti biofilm i ukloniti većinu bioopterećenja, ali imunološki odgovor domaćina može biti neučinkovit protiv preostalog biofilma, posebno ako je imunološki odgovor domaćina ugrožen. Dakle, antimikrobne terapije poput srebrnih obloga mogu podržati imunološki odgovor domaćina i eliminirati infekcije biofilma. Sastav, koncentracija, topljivost i supstrat za isporuku mogu utjecati na antimikrobnu učinkovitost srebra. Posljednjih godina, napredak u tehnologiji obrade srebra učinio je ove obloge učinkovitijima9,23. Kako tehnologija srebrnih obloga napreduje, važno je razumjeti učinkovitost ovih obloga u kontroli infekcije rane i, što je još važnije, utjecaj ovih potentnih oblika srebra na okolinu rane i zacjeljivanje.
U ovoj studiji usporedili smo učinkovitost dvaju naprednih srebrnih obloga s konvencionalnim srebrnim oblogama koje proizvode Ag1+ ione protiv biofilmova koristeći različite in vitro i in vivo modele. Također smo procijenili učinak ovih obloga na okolinu rane i zacjeljivanje neovisno o infekciji. Kako bi se smanjio utjecaj matrice za dostavu, sve testirane srebrne obloge sastojale su se od karboksimetilceluloze.
Naša preliminarna evaluacija ovih srebrnih obloga protiv kolonijalnih biofilmova Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus pokazuje da su, za razliku od tradicionalnih Ag1+ obloga, dva napredna srebrna obloga, Ag1+ + EDTA/BC i oksigenirane Ag soli, učinkovita pri 5. Učinkovito ubijajući bakterije biofilma unutar nekoliko dana. Osim toga, ovi oblogi sprječavaju ponovno stvaranje biofilma nakon ponovljenog izlaganja planktonskim bakterijama. Ag1+ obloga sadržavala je srebrni klorid, isti spoj srebra i osnovnu matricu kao Ag1+ + EDTA/BC, te je imala ograničen učinak na održivost bakterija unutar biofilma tijekom istog razdoblja. Opažanje da je Ag1+ + EDTA/BC obloga bila učinkovitija protiv biofilma od Ag1+ obloge koja se sastoji od iste matrice i spoja srebra podupire ideju da su potrebni dodatni sastojci za povećanje učinkovitosti srebrnog klorida protiv biofilma, kao što je već zabilježeno drugdje15. Ovi rezultati podupiru ideju da BC i EDTA igraju dodatnu ulogu koja doprinosi ukupnoj učinkovitosti zavoja te da je odsutnost ove komponente u zavojima s Ag1+ mogla doprinijeti neuspjehu u dokazivanju učinkovitosti in vitro. Otkrili smo da zavoji s oksigeniranim Ag solima koji proizvode Ag2+ i Ag3+ ione pokazuju jaču antibakterijsku učinkovitost od Ag1+ i to na razinama sličnim Ag1+ + EDTA/BC. Međutim, zbog visokog redoks potencijala, nije jasno koliko dugo Ag3+ ioni ostaju aktivni i učinkoviti protiv biofilmova rana te stoga zaslužuju daljnja istraživanja. Osim toga, postoje mnogi različiti zavoji koji generiraju Ag1+ ione koji nisu testirani u ovoj studiji. Ovi zavoji sastoje se od različitih spojeva srebra, koncentracija i baznih matrica, što može utjecati na isporuku Ag1+ iona i njihovu učinkovitost protiv biofilmova. Također je vrijedno napomenuti da postoje mnogi različiti in vitro i in vivo modeli koji se koriste za procjenu učinkovitosti zavoja za rane protiv biofilmova. Vrsta korištenog modela, kao i sadržaj soli i proteina u mediju koji se koristi u tim modelima, utjecat će na učinkovitost zavoja. U našem in vivo modelu, dopustili smo da biofilm sazrije in vitro, a zatim smo ga prenijeli na dermalnu površinu rane. Imunološki odgovor miša domaćina relativno je učinkovit protiv planktonskih bakterija nanesenih na ranu, čime se formira biofilm dok rana zacjeljuje. Dodavanje zrelog biofilma rani ograničava učinkovitost imunološkog odgovora domaćina na stvaranje biofilma dopuštajući zrelom biofilmu da se uspostavi unutar rane prije nego što može započeti zacjeljivanje. Dakle, naš model nam omogućuje da procijenimo učinkovitost antimikrobnih zavoja na zrelim biofilmovima prije nego što rane počnu zacjeljivati.
Također smo otkrili da pristajanje zavoja utječe na učinkovitost srebrnih zavoja na in vitro uzgojenim biofilmovima i svinjskoj koži. Bliski kontakt s ranom smatra se ključnim za antimikrobnu učinkovitost zavoja24,25. Zavoji koji sadrže oksigenirane Ag soli bili su u bliskom kontaktu sa zrelim biofilmovima, što je rezultiralo značajnim smanjenjem broja održivih bakterija unutar biofilma nakon 24 sata. Nasuprot tome, kada su tretirani zavojima Ag1+ i Ag1+ + EDTA/BC, značajan broj održivih bakterija ostao je. Ovi zavoji sadrže šavove duž cijele duljine zavoja, što stvara mrtve prostore koji sprječavaju bliski kontakt s biofilmom. U našim in vitro studijama, ova područja bez kontakta spriječila su ubijanje održivih bakterija unutar biofilma. Procijenili smo održivost bakterija tek nakon 24 sata tretmana; Tijekom vremena, kako zavoj postaje zasićeniji, može biti manje mrtvog prostora, smanjujući površinu za te održive bakterije. Međutim, to naglašava važnost sastava zavoja, a ne samo vrste srebra u zavoju.
Iako su in vitro studije korisne za usporedbu učinkovitosti različitih tehnologija srebra, važno je razumjeti i učinke ovih obloga na biofilmove in vivo, gdje tkivo domaćina i imunološki odgovori doprinose učinkovitosti obloga protiv biofilmova. Učinak ovih obloga na biofilmove rana promatran je pomoću skenirajuće elektronske mikroskopije i EPS bojenja biofilma pomoću unutarstaničnih i izvanstaničnih DNA boja. Otkrili smo da su nakon 3 dana liječenja svi oblogi bili učinkoviti u smanjenju DNA bez stanica u ranama zaraženim biofilmom, ali oblog Ag1+ bio je manje učinkovit u ranama zaraženim Staphylococcus aureusom. Skenirajuća elektronska mikroskopija također je pokazala da je u ranama tretiranim srebrnim oblogama prisutno značajno manje bakterija, iako je to bilo izraženije kod obloga s oksigeniranom Ag soli i obloga Ag1+ + EDTA/BC u usporedbi s oblogom Ag1+. Ovi podaci pokazuju da su testirani srebrni oblogi imali različite stupnjeve utjecaja na strukturu biofilma, ali nijedan od srebrnih obloga nije uspio iskorijeniti biofilm, što podupire potrebu za holističkim pristupom liječenju infekcija biofilma rana; korištenje srebrnih narukvica. Liječenju prethodi fizički debridement kako bi se uklonila većina biofilma.
Kronične rane često su u stanju teške upale, s viškom upalnih stanica koje ostaju u tkivu rane dulje vrijeme, uzrokujući oštećenje tkiva i iscrpljujući kisik potreban za učinkovit stanični metabolizam i funkciju u rani26. Biofilmovi pogoršavaju ovo neprijateljsko okruženje rane negativno utječući na zacjeljivanje na različite načine, uključujući inhibiciju proliferacije i migracije stanica te aktivaciju proupalnih citokina27. Kako srebrni oblogi postaju sve učinkovitiji, važno je razumjeti njihov utjecaj na okruženje rane i zacjeljivanje.
Zanimljivo je da, iako su svi srebrni zavoji utjecali na sastav biofilma, samo su zavoji s oksigeniranom srebrnom soli povećali ponovnu epitelizaciju tih inficiranih rana. Ovi podaci podupiru naše prethodne nalaze17 i one Kalana i suradnika (2017.)28, koji su pokazali dobre profile sigurnosti i toksičnosti oksigeniranih srebrnih soli, budući da su niže koncentracije srebra bile učinkovite protiv biofilmova.
Naša trenutna studija ističe razlike u tehnologiji srebra između antimikrobnih srebrnih zavoja i utjecaj ove tehnologije na okruženje rane i zacjeljivanje neovisno o infekciji. Međutim, ovi rezultati se razlikuju od prethodnih studija koje su pokazale da Ag1+ + EDTA/BC zavoj poboljšava parametre zacjeljivanja ozlijeđenih zečjih ušiju in vivo. Međutim, to može biti zbog razlika u životinjskim modelima, vremenima mjerenja i metodama primjene bakterija29. U ovom slučaju, mjerenja rane provedena su 12 dana nakon ozljede kako bi se aktivnim sastojcima zavoja omogućilo da djeluju na biofilm tijekom duljeg vremenskog razdoblja. To potvrđuje studija koja je pokazala da su se klinički inficirani ulkusi na nogama liječeni s Ag1+ + EDTA/BC u početku povećavali nakon jednog tjedna liječenja, a zatim tijekom sljedeća 3 tjedna liječenja s Ag1+ + EDTA/BC i unutar 4 tjedna korištenja neantimikrobnih lijekova. CMC zavoji za smanjenje veličine ulkusa30.
Prethodno je pokazano da su određeni oblici i koncentracije srebra citotoksični in vitro 11, ali ovi in vitro rezultati ne prenose se uvijek na štetne učinke in vivo. Osim toga, napredak u tehnologiji srebra i bolje razumijevanje spojeva srebra i koncentracija u zavojima doveli su do razvoja mnogih sigurnih i učinkovitih zavoja sa srebrom. Međutim, kako tehnologija zavoja sa srebrom napreduje, važno je razumjeti utjecaj tih zavoja na okolinu rane 31, 32, 33. Prethodno je objavljeno da povećana stopa reepitelizacije odgovara povećanom udjelu protuupalnih M2 makrofaga u usporedbi s proupalnim M1 fenotipom. To je zabilježeno u prethodnom mišjem modelu gdje su zavoji za rane od srebrnog hidrogela uspoređivani sa srebrnim sulfadiazinom i neantimikrobnim hidrogelovima 34.
Kronične rane mogu pokazivati pretjeranu upalu, a uočeno je da prisutnost viška neutrofila može biti štetna za zacjeljivanje rana35. U studiji na miševima s nedostatkom neutrofila, prisutnost neutrofila odgodila je reepitelizaciju. Prisutnost viška neutrofila dovodi do visokih razina proteaza i reaktivnih vrsta kisika, poput superoksida i vodikovog peroksida, koji su povezani s kroničnim i sporo zacjeljujućim ranama37,38. Slično tome, povećanje broja makrofaga, ako se ne kontrolira, može dovesti do odgođenog zacjeljivanja rana39. Ovo povećanje je posebno važno ako makrofagi nisu u mogućnosti prijeći iz proupalnog fenotipa u pro-zacjeljujući fenotip, što rezultira time da rane ne uspijevaju izaći iz upalne faze zacjeljivanja40. Uočili smo smanjenje neutrofila i makrofaga u ranama zaraženim biofilmom nakon 3 dana liječenja svim srebrnim zavojima, ali smanjenje je bilo izraženije kod zavoja s oksigeniranom soli. Ovo smanjenje može biti izravna posljedica imunološkog odgovora na srebro, odgovora na smanjeno biološko opterećenje ili činjenice da je rana u kasnijoj fazi zacjeljivanja te su stoga imunološke stanice u rani smanjene. Smanjenje broja upalnih stanica u rani može održavati okruženje pogodno za zacjeljivanje rane. Mehanizam djelovanja Ag oksisoli potiče zacjeljivanje neovisno o infekciji nije jasan, ali sposobnost Ag oksisoli da proizvode kisik i uništavaju štetne razine vodikovog peroksida, medijatora upale, mogla bi to objasniti i zahtijeva daljnja istraživanja17.
Kronične inficirane rane koje ne zacjeljuju predstavljaju problem i za liječnike i za pacijente. Iako mnogi zavoji tvrde da imaju antimikrobnu učinkovitost, istraživanja se rijetko usredotočuju na druge ključne čimbenike koji utječu na mikrookruženje rane. Ova studija pokazuje da različite tehnologije srebra imaju različitu antimikrobnu učinkovitost i, što je važno, različite učinke na okruženje rane i zacjeljivanje, neovisno o infekciji. Iako ove in vitro i in vivo studije pokazuju učinkovitost ovih zavoja u liječenju infekcija rana i poticanju zacjeljivanja, potrebna su randomizirana kontrolirana ispitivanja kako bi se procijenila učinkovitost ovih zavoja u klinici.
Skupovi podataka korišteni i/ili analizirani tijekom ove studije dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev.
Vrijeme objave: 15. srpnja 2024.