Hvala vam što ste posjetili prirodu.com. Verzija preglednika koji koristite ima ograničenu CSS podršku. Za najbolje rezultate, preporučujemo vam da koristite noviju verziju svog preglednika (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali stalnu podršku, prikazujemo web mjesto bez stila ili JavaScript.
Rast mikroba u ranama često se očituje kao biofilmi, koji ometaju ozdravljenje i teško ih je iskorijeniti. Novi srebrni preljevi tvrde da se bore protiv infekcija rana, ali njihova učinkovitost antibiofilma i iscjeliteljski učinci neovisni o infekciji uglavnom su nepoznati. Koristeći in vitro i in vivo biofilmske modele Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa, izvještavamo o učinkovitosti preljeva Ag1+ iona; Ag1+ preljevi koji sadrže etilendiaminetetraoctena kiselina i benzetonijev klorid (Ag1+/EDTA/BC), te preljeve koji sadrže srebrni nitrat (AGSYSALTS). , koji proizvode ione Ag1+, Ag2+ i Ag3+ za borbu protiv biofilma rana i njegov utjecaj na zacjeljivanje. Ag1+ preljevi imali su minimalne učinke na biofilm rana in vitro i na miševima (C57BL/6J). Suprotno tome, preljeve s kisikom AG i Ag1+/EDTA/BC značajno su smanjili broj održivih bakterija u biofilmima in vitro i pokazali značajno smanjenje komponenti bakterija i EPS u biofilmima rana miša. Ovi preljevi imali su različite učinke na ozdravljenje rana zaraženih biofilmom i ne-biofilma, a preljevi s kisikom soli imaju više korisnih učinaka na reepitelizaciju, veličinu rane i upalu u usporedbi s kontrolnim tretmanima i drugim srebrnim preljevima. Različita fizikalno-kemijska svojstva srebrnih preljeva mogu imati različite učinke na biofilm i zacjeljivanje rana, a to treba uzeti u obzir pri odabiru preljeva za liječenje rana zaraženih biofilmom.
Kronične rane definiraju se kao "rane koje ne uspijevaju napredovati kroz normalne faze ozdravljenja na uredan i pravovremeni način" 1. Kronične rane stvaraju psihološki, socijalni i ekonomski teret za pacijente i zdravstveni sustav. Godišnja potrošnja NHS -a na liječenje rana i povezanih komorbiditeta procjenjuje se na 8,3 milijarde funti u 2017. -182. Kronične rane trenutno su gorući problem u Sjedinjenim Državama, a Medicare je procjenjivao godišnje troškove liječenja bolesnika s ranama od 28,1 do 96,8 milijardi dolara.
Infekcija je glavni faktor koji sprečava zacjeljivanje rana. Infekcije se često manifestiraju kao biofilmi, koji su prisutni u 78% kroničnih rana koji nisu zacjeljivali. Biofilmi se formiraju kada mikroorganizmi postanu nepovratno pričvršćeni na površine, poput površina rana, i mogu se objediniti kako bi formirali izvanstanični polimer (EPS) koje proizvode zajednice. Biofilm rane povezan je s povećanim upalnim odgovorom koji dovodi do oštećenja tkiva, što može odgoditi ili spriječiti ozdravljenje4. Povećanje oštećenja tkiva može dijelom biti posljedica povećane aktivnosti matriksnih metaloproteinaza, kolagenaze, elastaze i reaktivnih kisika5. Nadalje, upalne stanice i biofilmi sami su visoki potrošači kisika i stoga mogu uzrokovati lokalnu hipoksiju tkiva, iscrpljujući stanice vitalnog kisika potrebnih za učinkovito popravljanje tkiva6.
Zreli biofilmi su vrlo otporni na antimikrobna sredstva, što zahtijeva agresivne strategije za kontrolu infekcija biofilma, poput mehaničkog tretmana, praćenog učinkovitom antimikrobnom liječenjem. Budući da se biofilmi mogu brzo regenerirati, učinkoviti antimikrobni brodovi mogu smanjiti rizik od ponovne formacije nakon kirurškog debridmana7.
Srebro se sve više koristi u antimikrobnim preljevima i često se koristi kao tretman prve linije za kronične zaražene rane. Mnogo je komercijalno dostupnih srebrnih preljeva, od kojih svaki sadrži različitu srebrni sastav, koncentraciju i osnovnu matricu. Napredak u srebrnim trakama doveo je do razvoja novih srebrnih ručica. Metalni oblik srebra (AG0) je inertan; Da bi se postigla antimikrobna učinkovitost, mora izgubiti elektron kako bi formirao ionsko srebro (Ag1+). Tradicionalni srebrni preljevi sadrže srebrne spojeve ili metalno srebro koji se, kad su izloženi tekućini, razgrađuju u formiranje Ag1+ iona. Ovi ioni Ag1+ reagiraju s bakterijskom ćelijom, uklanjajući elektrone iz strukturnih komponenti ili kritičnih procesa potrebnih za preživljavanje. Patentirana tehnologija dovela je do razvoja novog srebrnog spoja, Ag Oxysalts (srebrni nitrat, Ag7no11), koji je uključen u preljeve za rane. Za razliku od tradicionalnog srebra, raspadanje soli koje sadrže kisik proizvodi stanja srebra s većom valencijom (Ag1+, Ag2+i Ag3+). In vitro studije pokazale su da su niske koncentracije srebrne soli s kisikom učinkovitije od jednostrukog ionskog srebra (Ag1+) protiv patogenih bakterija poput Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i Escherichia coli8,9. Druga nova vrsta srebrnog preljeva uključuje dodatne sastojke, naime etilendiaminetetraoctene kiseline (EDTA) i benzetonijev klorid (BC), za koje se navodi da ciljaju EPS biofilm i na taj način povećavaju prodor srebra u biofilm. Ove nove srebrne tehnologije nude nove načine ciljanja biofilma rana. Međutim, utjecaj ovih antimikrobnih lijekova na okoliš rane i zacjeljivanje neovisnog o infekciji važan je kako bi se osiguralo da oni ne stvaraju nepovoljno okruženje rana ili odgađa zacjeljivanje. Zabrinutosti zbog in vitro srebrne citotoksičnosti zabilježene su s nekoliko srebrnih preljeva10,11. Međutim, in vitro citotoksičnost još nije prevedena u toksičnost in vivo, a nekoliko preljeva Ag1+ pokazalo je dobar sigurnosni profil12.
Ovdje smo istražili učinkovitost preljeva karboksimetilceluloze koje sadrže nove srebrne formulacije protiv biofilma rane in vitro i in vivo. Pored toga, procijenjeni su učinci ovih preljeva na imunološke odgovore i iscjeljenje neovisno o infekciji.
Svi preljevi korišteni su komercijalno dostupni. 3M Kerracel gel vlaknasti preljev (3M, Knutsford, Velika Britanija) je ne-antimikrobni 100% karboksimetilceluloza (CMC) preljev od gel vlakana koji se koristio kao kontrolni preljev u ovoj studiji. Procijenjena su tri antimikrobna CMC srebrna preljeva, naime 3M Kerracel AG preljev (3M, Knutsford, Velika Britanija), koji sadrži 1,7 mas.%. Silver sol s kisikom (Ag7no11) u ionima viših valentnih srebra (Ag1+, Ag2+i Ag3+). Tijekom raspadanja Ag7no11, ioni AG1+, Ag2+ i Ag3+ nastaju u omjeru 1: 2: 4. Aquacel AG dodatni preljev koji sadrži 1,2% srebrnog klorida (Ag1+) (Convatec, Deeside, Velika Britanija) 13 i Aquacel Ag+dodatni preljev koji sadrži 1,2% srebrnog klorida (Ag1+), EDTA i benzetonijev klorid (Consatec, Deeside, Velika Britanija) 14.
Sojevi korišteni u ovom istraživanju bili su Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (javno zdravstvo England, Salisbury) i Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Bakterije su uzgajane preko noći u Muller-Hinton juhu (Oxoid, Altrincham, Velika Britanija). Kultura preko noći tada je razrijeđena 1: 100 u Mueller-Hintonovom juhu i 200 µl pozvana na sterilne membrane ciklopora od 0,2 µm Whatman (Whatman Plc, Maidstone, Velika Britanija) na ploče Mueller-Hinton Agar (Sigma-Aldrich Company Ltd, Velika Britanija ). ) Kolonijalno stvaranje biofilma na 37 ° C tokom 24 sata. Ti su kolonijalni biofilmi testirani na logaritamsko skupljanje.
Preljev izrežite na 3 cm2 četvornih komada i pre-moren sterilnom deioniziranom vodom. Postavite zavoj preko biofilma kolonije na ploču agara. Svaka 24 ha biofilma je uklonjena, a održive bakterije unutar biofilma (CFU/mL) kvantificirane su serijskim razrjeđivanjem (10-1 do 10-7) u juhu od neutralizacije dnevnog kuta (Merck-Millipore). Nakon 24 sata inkubacije na 37 ° C, na pločima Mueller-Hinton Agar izvedene su standardne brojeve ploča. Svaki tretman i vremenska točka izvedeni su u tri primjerka, a brojevi ploča ponovljeni su za svako razrjeđivanje.
Koža svinjskog trbuha dobiva se od velikih bijelih svinja u roku od 15 minuta od klanja u skladu s izvoznim standardima Europske unije. Koža je obrijana i očišćena alkoholnim maramicama, a zatim zamrznuta na -80 ° C tokom 24 sata kako bi se devitalizirala koža. Nakon odmrzavanja, komadići kože 1 cm2 isprani su tri puta s PBS -om, 0,6% natrijevim hipokloritom i 70% etanola 20 minuta svaki put. Prije uklanjanja epiderme, uklonite preostali etanol ispiranjem 3 puta u sterilnim PBS -u. Koža je uzgajana u ploči sa 6 jažica s najlonskom membranom debljine 0,45 µm (Merck-Millipore) na vrhu i 3 apsorbirajuća jastučića (Merck-Millipore) koji sadrže 3 ml fetalne goveđe serume (Sigma) nadopunjenim s 10% Dulbeccovog modificiranog Orao. Srednji (Dulbeccov modificirani orlo medij - Aldrich Ltd.).
Kolonijalni biofilmi su uzgajani kako je opisano za studije izloženosti biofilma. Nakon kultiviranja biofilma na membrani 72 sata, biofilm je nanesen na površinu kože pomoću petlje sterilne inokulacije i membrana je uklonjena. Biofilm je zatim inkubiran na svinjskom dermisu dodatnih 24 sata na 37 ° C kako bi se biofilm sazrijevao i pridržavao se kože svinje. Nakon što je biofilm sazrio i pričvršćen, preljev od 1,5 cm2, prethodno prekriven sterilnom destiliranom vodom, nanesen je izravno na površinu kože i inkubiran na 37 ° C 24 sata. Održive bakterije vizualizirane su bojenjem jednoličnim primjenom prestoblue stanične održivosti reagensa (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Velika Britanija) na apikalnu površinu svakog eksplantata i inkubirajući je 5 minuta. Upotrijebite digitalni fotoaparat Leica DFC425 kako biste odmah snimili slike na mikroskopu Leica MZ8. Područja obojena ružičasta kvantificirana su korištenjem Image Pro Software verzije 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (Mediacy.com)). Skeniranje elektronske mikroskopije izvedena je kako je opisano u nastavku.
Bakterije uzgojene preko noći razrijeđene su 1: 100 u Muellerovoj-Hintonskoj juhi. 200 μl kulture dodano je sterilnoj membrani ciklopora od 0,2 µM Whatmana (Whatman, Maidstone, Velika Britanija) i pozlaćeno na Mueller-Hinton Agar. Ploče za biofilm inkubirane su na 37 ° C 72 sata kako bi se omogućilo zrelo stvaranje biofilma.
Nakon 3 dana sazrijevanja biofilma, kvadratni zavoj 3 cm2 stavljen je izravno na biofilm i inkubiran na 37 ° C 24 sata. Nakon uklanjanja zavoja s površine biofilma, na površinu svakog biofilma 20 sekundi dodano je 1 ml prestoblue stanične vitalnosti (Invitrogen, Waltham, MA). Površine su osušene prije nego što su promjene boje zabilježene pomoću digitalnog fotoaparata Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, Velika Britanija).
Pripremite kulture preko noći na Mueller-Hinton Agar, prebacite pojedinačne kolonije na 10 ml Mueller-Hinton juhe i inkubirajte na shakeru na 37 ° C (100 o / min). Nakon inkubacije preko noći, kultura je razrijeđena 1: 100 u Mueller-Hinton juhi, a 300 ul je primijećeno na 0,2 µm kružnoj cikloporskoj membrani Whatmana (Whatman International, Maidstone, Velika Britanija) na Mueller-Hinton Agar i inkubirana na 37 ° C u roku od 72 sata u roku od 37 ° C u roku od 37 ° C . . Zreli biofilm primijenjen je na ranu kako je opisano u nastavku.
Svi rad sa životinjama provedeni su na Sveučilištu u Manchesteru pod licencom projekta koju je odobrio Ured za dobrobit životinja i etički pregled (P8721BD27), a u skladu s smjernicama koje je matični ured objavio u okviru revidiranog ASPA iz 2012. godine. Svi su se autori pridržavali smjernica za dolazak. Za sve in vivo studije korišteni su osmotjedni C57BL/6J miševi (Envigo, Oxon, Velika Britanija). Miševi su anestezirani izofluranom (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Velika Britanija), a njihove su dorzalne površine obrijane i očišćene. Svaki je miš je tada dobio ekscizijsku ranu od 2 × 6 mm pomoću Stiefel Biopsy Punch (Schuco International, Hertfordshire, Velika Britanija). Za rane zaražene biofilmom nanesite 72-satni kolonijalni biofilm uzgojen na membrani kako je gore opisano na dermalni sloj rane pomoću sterilne inokulacijske petlje odmah nakon ozljede i odbaciti membranu. Jedan kvadratni centimetar preljeva unaprijed je prepun sterilne vode kako bi se održao vlažno rana. Preljevi su naneseni izravno na svaku ranu i prekriveni 3M Tegaderm filmom (3M, Bracknell, Velika Britanija) i mastisol tekućim ljepilom (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) primijenjeni su oko rubova kako bi se pružila dodatna adhezija. Buprenorfin (AnimalCare, York, Velika Britanija) primijenjen je u koncentraciji od 0,1 mg/kg kao analgetik. Cull miševi tri dana nakon ozljede primjenom metode Prilog 1 i uklonite, prepolovite i pohranjuju područje rane prema potrebi.
Bojenje hematoksilina (Thermofisher Scientific) i Eozin (Thermofisher Scientific) izvedeni su prema protokolu proizvođača. Područje rana i reepitelizacija kvantificirane su pomoću Image Pro softverske verzije 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Odjeljci tkiva su ukinuti u ksilenu (Thermofisher Scientific, Loughborough, Velika Britanija), rehidrirani sa 100–50% stupnjevanim etanolom i kratko uronjeni u deioniziranu vodu (Thermofisher Scientific). Imunohistokemija je izvedena korištenjem kompleta Vectastain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) prema protokolu proizvođača. Primarna antitijela na neutrofile nimp-r14 (Thermofisher Scientific) i makrofagi MS CD107B Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, Velika Britanija) razrijeđena su 1: 100 u blokirajskoj otopini i dodana na površinu izrezanja, a slijedi 2 antitijela Anti-, Vektastain ABC i Vector Nova Red Peroxidase (HRP) supstrat komplet (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i suprotstavljeni hematoksilinom. Slike su dobivene pomoću Olympus BX43 mikroskopa i digitalnog fotoaparata Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, Velika Britanija).
Uzorci kože fiksirani su u 2,5% glutaraldehidu i 4% formaldehida u 0,1 M HEPES (pH 7,4) tijekom 24 sata na 4 ° C. Uzorci su dehidrirani pomoću stupnjevanog etanola i osušeni u CO2 pomoću sušilice Kvorum K850 kritične točke (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Velika Britanija) i raspršivača obložena legurom zlatnog palladija pomoću kvoruma SC7620 Mini SputterEr/SLOW ispraznjenje. Uzorci su snimljeni pomoću FEI Quanta 250 skenirajućeg elektronskog mikroskopa (Thermofisher Scientific) kako bi se vizualizirala središnja točka rane.
Toto-1 jodid (2 µM) primijenjen je na izrezanu površinu rane mišje i inkubiran 5 minuta na 37 ° C (termofir znanstveno) i tretiran sa SYTO-60 (10 µM) na 37 ° C (ThermoFisher Scientific). 15-minutne slike z-stacka stvorene su pomoću Leica TCS SP8.
Biološki i tehnički replicirani podaci tabelirani su i analizirani pomoću programa GraphPad Prism V9 softver (GraphPad Software, La Jolla, CA). Jednosmjerna analiza varijance s višestrukim usporedbama pomoću Dunnettovog post-hoc testa korištena je za ispitivanje razlika između svakog tretmana i ne-antimikrobnog upravljačkog preljeva. P vrijednost <0,05 smatrana je značajnom.
Učinkovitost vlaknastih preljeva od srebrnog gel -a prvo je procijenjena na kolonijama biofilma Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa in vitro. Srebrni preljevi sadrže različite formule srebra: tradicionalni srebrni preljevi proizvode ag1+ ioni; Srebrni preljevi, koji mogu proizvesti ione Ag1+ nakon dodavanja EDTA/BC, mogu uništiti matricu biofilma i izložiti bakterije srebrom pod antibakterijskim učinkom srebra. ioni15 i preljevi koji sadrže kisične ag soli koje proizvode ine Ag1+, Ag2+ i Ag3+. Njegova učinkovitost uspoređena je s ne-antimikrobnim upravljačkim preljevom izrađenim od geliranih vlakana. Preostale održive bakterije unutar biofilma procijenjene su svaka 24 sata tijekom 8 dana (slika 1). 5. dana, biofilm je renokuliran sa 3,85 × 105s. Staphylococcus aureus ili 1,22 × 105p. aeruginosa za procjenu oporavka biofilma. U usporedbi s ne-antimimikrobnim upravljačkim preljevima, preljevi AG1+ imali su minimalan utjecaj na bakterijsku održivost u biofilmima Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa tijekom 5 dana. Suprotno tome, preljeve koji sadrže kisika AG i Ag1 + + EDTA/BC soli bili su učinkoviti u ubijanju bakterija unutar biofilma u roku od 5 dana. Nakon ponovljene inokulacije planktonske bakterije 5. dana, nije primijećena obnavljanje biofilma (Sl. 1).
Kvantifikacija održivih bakterija u biofilmima Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa nakon tretmana srebrnim preljevima. Kolonije biofilma Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa tretirane su srebrnim preljevima ili ne-antimimikrobnim upravljačkim preljevima, a broj preostalih održivih bakterija određen je svaka 24 sata. Nakon 5 dana, biofilm je renokuliran s 3,85 × 105s. Staphylococcus aureus ili 1,22 × 105p. Kolonije bakterioplanktona Pseudomonas aeruginosa formirane su pojedinačno kako bi se procijenila oporavak biofilma. Grafikoni prikazuju srednju +/- standardnu pogrešku.
Kako bi se vizualizirao učinak srebrnih preljeva na održivost biofilma, preljevi su naneseni na zrele biofilme uzgojene na svinjsku kožu ex vivo. Nakon 24 sata preljev se uklanja, a biofilm je obojen plavom reaktivnom bojom, koja se metabolizira živim bakterijama u ružičastu boju. Biofilmi tretirani kontrolnim preljevima bili su ružičasti, što ukazuje na prisutnost održivih bakterija unutar biofilma (slika 2A). Suprotno tome, biofilm tretiran preljevom Ag Oxysols bio je prvenstveno plavi, što ukazuje na to da su preostale bakterije na površini svinjske kože bile nežive bakterije (Slika 2B). Mješovita plava i ružičasta boja uočena je u biofilmima tretiranim preljevima koji sadrže Ag1+, što ukazuje na prisutnost održivih i ne-održivih bakterija unutar biofilma (slika 2c), dok su preljevi EDTA/BC koji sadrže Ag1+ pretežno plavi s nekim ružičastim spotovima. što označava područja na koja ne utječu srebrni preljev (slika 2d). Kvantifikacija aktivnih (ružičastih) i neaktivnih (plavih) područja pokazala je da je kontrolni flaster bio 75% aktivan (slika 2E). Ag1 + + EDTA/BC preljevi izvedeni slično kao preljevi od soli s kisikom, s stopama preživljavanja od 13%, odnosno 14%. Ag1+ preljev također je smanjio održivost bakterija za 21%. Ti su biofilmi tada primijećeni korištenjem skenirajuće elektronske mikroskopije (SEM). Nakon tretmana kontrolnim preljevom i preljevom Ag1+, primijećen je sloj pseudomonas aeruginosa koji pokriva kožu svinja (slika 2f, h), dok je nakon liječenja preljevom Ag1+ pronađeno malo bakterijskih stanica i pronađeno je malo bakterijskih stanica. Kolagena vlakna mogu se smatrati tkivnom strukturom svinjske kože (slika 2G). Nakon tretmana Ag1 + + EDTA/BC preljevom, vidljivi su bakterijski plakovi i podlozi za kolagene vlakna (Slika 2I).
Vizualizacija biofilma pseudomonas aeruginosa nakon tretmana srebrnim odijevanjem. (A-D) Bakterijska održivost u biofilmima Pseudomonas aeruginosa uzgajana na svinjskoj koži vizualizirana je korištenjem prestoblue održivosti boje 24 sata nakon tretmana srebrnim preljevima ili ne-antimikrobnim upravljačkim preljevima. Žive bakterije su ružičaste, ne održive bakterije, a svinjska koža su plava. (E) Kvantifikacija biofilma pseudomonas aeruginosa uzgojena na svinjskoj koži (ružičasta mrlja) pomoću skenirajuće elektronske mikroskopske slike Pro verzije 10 (FI) i obrađena srebrnim preljevom ili ne-antimikrobnim upravljačkim preljevom 24 sata. SEM ljestvica = 5 µm. (J - M) Kolonijalni biofilmi rasli su na filtrima i obojeni prestoblue reaktivnom bojom nakon 24 sata inkubacije sa srebrnim preljevima.
Da bi se utvrdilo je li bliski kontakt između preljeva i biofilma utjecao na učinkovitost preljeva, kolonijalni biofilmi postavljeni na ravnu površinu tretirani su preljevima 24 sata, a zatim obojeni reaktivnim bojama. Neliječeni biofilm bio je tamno ružičaste boje (slika 2J). Za razliku od biofilma tretiranih preljevima koji sadrže kisikove ag soli (slika 2K), biofilmi tretirani preljevima koji sadrže Ag1+ ili Ag1++ EDTA/BC pokazali su trake ružičastog bojenja (slika 2L, M). Ova ružičasta boja ukazuje na prisutnost održivih bakterija i povezana je s područjem šava unutar preljeva. Ova ušivena područja stvaraju mrtve prostore koji omogućuju preživljavanje bakterija unutar biofilma.
Da bi se procijenila učinkovitost srebrnih preljeva in vivo, rane pune debljine miševa zaražene zrelim S. aureus i P. aeruginosa biofilmi tretirane su s nonantimikrobnim upravljačkim pregradama ili srebrnim preljevima. Nakon 3 dana liječenja, makroskopska analiza slike pokazala je manju veličinu rane kada se tretira s preljevima od kisikovih soli u usporedbi s ne-antimimikrobnim upravljačkim preljevima i drugim srebrnim preljevima (slika 3A-H). Da bi se potvrdile ta opažanja, rane su sakupljene i područje rana, a reepitelizacija je kvantificirana na odjeljcima tkiva obojenih hematoksilinom i eozinom pomoću softvera Image Pro verzije 10 (Slika 3I-L).
Učinak srebrnih preljeva na površinu rane i re-epitelizaciju rana zaraženih biofilmima. (A - H) Male stanice zaražene biofilmima Pseudomonas aeruginosa (A -D) i Staphylococcus aureus (E -H) nakon tri dana liječenja neantimikrobnim upravljačkim preljevom, preljevom od soli s kisikom, ag1+ preljev i Ag1+ zavoj. Reprezentativne makroskopske slike. Rane miševa s Ag1 + + EDTA/BC preljevom. (IL) Reprezentativna infekcija pseudomonas aeruginosa, histološki presjeci obojeni hematoksilinom i eozinom, koji se koriste za kvantificiranje područja rane i regeneracije epitela. Kvantifikacija površine rane (M, O) i postotna reepitelizacija (N, P) rana zaraženih pseudomonas aeruginosa (M, N) i Staphylococcus aureus (O, P) biofilmi (po grupi liječenja n = 12). Grafikoni prikazuju srednju +/- standardnu pogrešku. * znači p = <0,05 ** znači p = <0,01; Makroskopska skala = 2,5 mm, histološka skala = 500 um.
Kvantifikacija područja rana u ranama zaraženim pseudomonas aeruginosa biofilmom (slika 3M) pokazalo je da rane tretirane Ag oksisaltima imaju prosječnu veličinu rane od 2,5 mm2, dok je ne-antimikrobni upravljački preljev imao prosječnu veličinu rane od 3,1 mm2, što nije, što nije, što nije, što nije, što nije, što nije, što nije pravi. dostigao statističku značajnost (slika 3M). P = 0,423). Rane liječene Ag1+ ili Ag1++ EDTA/BC nisu pokazale smanjenje površine rane (3,1 mm2 i 3,6 mm2, respektivno). Liječenje s kisikovim preljevom od soli u većoj mjeri potiče ponovno epitelizaciju od ne-antimikrobnog upravljačkog preljeva (34% i 15%, respektivno; P = 0,029) i Ag1+ ili Ag1++ EDTA/BC (10% i 11%) ( Slika 3n). . , odnosno).
Slični trendovi u području rana i regeneracija epitela zabilježeni su u ranama zaraženim biofilmima S. aureus (Slika 3O). Preljevi koji sadrže srebrne soli s kisikom smanjile su površinu rane (2,0 mm2) za 23% u usporedbi s kontrolnim ne-antimikrobnim preljevom (2,6 mm2), iako ovo smanjenje nije bilo značajno (P = 0,304) (Sl. 3O). Pored toga, područje rane u skupini za liječenje AG1+ blago je smanjeno (2,4 mm2), dok rana tretirana s preljevom Ag1++ EDTA/BC nije smanjila područje rane (2,9 mm2). Kisikove soli AG-a također su u veću mjeru potaknule reepitelizaciju rana zaraženih biofilmom S. aureus (31%) od onih tretiranih ne-antimikrobnim upravljačkim preljevima (12%, p = 0,003) (Slika 3p). Ag1+ preljev (16%, p = 0,903) i Ag+ 1+ EDTA/BC preljev (14%, p = 0,965) pokazali su razinu regeneracije epitela slične kontroli.
Da bi se vizualizirao učinak srebrnih preljeva na matricu biofilma, izvedeno je bojenje Toto 1 i Syto 60 jodida (Sl. 4). Toto 1 jodid je stanična boja koja se može koristiti za precizno vizualizaciju izvanstaničnih nukleinskih kiselina, koje su u obilu EPS-a biofilma. SYTO 60 je stanica za propusnost ćelije koja se koristi kao kontrastain16. Promatranja Toto 1 i Syto 60 jodida u ranama inokuliranim biofilmima pseudomonas aeruginosa (slika 4A-D) i Staphylococcus aureus (slika 4i-l) pokazala su da su nakon 3 dana obrade preljeva EPS u biofilmu značajno smanjeni. koje sadrže kisikove soli Ag i Ag1 + + EDTA/BC. Ag1+ preljevi bez dodatnih antibiofilmskih komponenti značajno su smanjile DNK bez stanica u ranama inokuliranim pseudomonas aeruginosa, ali su manje učinkovite u ranama inokuliranim Staphylococcus aureus.
In vivo snimanje biofilma rana nakon 3 dana liječenja kontrolnim ili srebrnim preljevima. Konfokalne slike pseudomonas aeruginosa (A - D) i Staphylococcus aureus (I -L) obojene s Toto 1 (zeleno) za vizualizaciju izvanstaničnih nukleinskih kiselina, komponente polimera izvanstaničnih biofilma. Da biste obojili unutarćelijske nukleinske kiseline, koristite SYTO 60 (crveno). kiseline. P. Skenirajući elektronska mikroskopija rana zaraženih pseudomonas aeruginosa (E -H) i Staphylococcus aureus (M -P) nakon 3 dana liječenja kontrolnim i srebrnim preljevima. SEM ljestvica = 5 µm. Konfokalna traka ljestvice za snimanje = 50 µm.
Skenirajuća elektronska mikroskopija pokazala je da su miševi inokulirani kolonijama biofilma pseudomonas aeruginosa (slika 4E-H) i Staphylococcus aureus (slika 4M-P) imali značajno manje bakterija u svojim ranama nakon 3 dana liječenja svim srebrnim preljevima.
Da bi se procijenio učinak srebrnih preljeva na upalu rana kod miševa zaraženih biofilmom, dijelovi rana zaraženih biofilmom tretirani kontrolnim ili srebrnim preljevima tijekom 3 dana bili su imunohistokemijski obojeni pomoću antitijela specifičnih za neutrofile i makrofage. Kvantitativno određivanje neutrofila i makrofaga interno. granulacijsko tkivo. Slika 5). Svi srebrni preljevi smanjili su broj neutrofila i makrofaga u ranama zaraženim pseudomonas aeruginosa u usporedbi s ne-antimikrobnim upravljačkim preljevima nakon tri dana liječenja. Međutim, liječenje preljevom od srebrne soli s kisikom rezultiralo je većim smanjenjem neutrofila (p = <0,0001) i makrofaga (p = <0,0001) u usporedbi s drugim testiranim srebrnim preljevima (Slika 5i, J). Iako je Ag1++ EDTA/BC imao veći utjecaj na biofilm rana, smanjio je razinu neutrofila i makrofaga u manjoj mjeri od preljeva Ag1+. Umjerene rane zaražene biofilmom S. aureus također su primijećene nakon preljeva s Ag (P = <0,0001), Ag1+ (P = 0,0008) i Ag1 ++ EDTA/BC (P = 0,0043) oksisola u usporedbi s kontrolom. Slični trendovi primijećeni su i kod neutropenije. zavoj (sl. 5k). Međutim, samo kisikov preljev AG soli pokazao je značajno smanjenje broja makrofaga u granulacijskom tkivu u usporedbi s kontrolom u ranama zaraženim biofilmima S. aureus (P = 0,0339) (Slika 5L).
Neutrofili i makrofagi kvantificirani su u ranama zaraženim pseudomonas aeruginosa i staphylococcus aureus biofilmima nakon 3 dana liječenja ne-antimikrobnom kontrolom ili srebrnim preljevima. Neutrofili (AD) i makrofagi (EH) kvantificirani su u tkivnim dijelovima obojenim antitijelima specifičnim za neutrofile ili makrofage. Kvantifikacija neutrofila (I i K) i makrofaga (j i L) u ranama zaraženim pseudomonas aeruginosa (I i J) i stafilokokUs aureus (K&L). N = 12 po grupi. Grafikoni prikazuju srednju +/-standardnu pogrešku, vrijednosti značajnosti u usporedbi s ne-antibakterijskim upravljačkim preljevom, * znači p = <0,05, ** znači p = <0,01; *** znači p = <0,001; označava p = <0,0001).
Zatim smo procijenili učinak srebrnih preljeva na zacjeljivanje neovisno o infekciji. Ekscizijske rane koje nisu zaražene tretirane su ne-antimikrobnim upravljačkim preljevom ili srebrnim preljevom 3 dana (slika 6). Među ispitanim srebrnim preljevima, samo su rane tretirane s kisikovim preljevom od soli izgledale manje na makroskopskim slikama od rana tretiranih kontrolom (slika 6A-D). Kvantifikacija površine rana pomoću histološke analize pokazala je da je prosječna površina rane nakon obrade preljevom Ag Oxysols iznosila 2,35 mm22 u usporedbi s 2,96 mm2 za rane liječene kontrolnom skupinom, ali ta razlika nije dosegla statističku značajnost (P = 0,488) (Sl. . 6i). Suprotno tome, nakon liječenja s Ag1+ (3,38 mm2, p = 0,757) ili Ag1++ EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) nije primijećeno smanjenjem smanjenja niženja. Povećana regeneracija epitela primijećena je s preljevom Ag Oxysol u usporedbi s kontrolnom skupinom (30% prema 22%, respektivno), iako to nije dostiglo značaj (p = 0,067), ovo je prilično značajno i potvrđuje prethodne rezultate. Preljev s Oxysolsom potiče ponovnu epitelizaciju. -Epitelizacija neinficiranih rana17. Suprotno tome, liječenje s Ag1+ ili Ag1++ EDTA/BC preljevima nije imalo učinka ili je pokazalo smanjenu ponovnu epitelizaciju u usporedbi s kontrolom.
Učinak srebrnog presvlačenja rana na zacjeljivanje rana kod neinficiranih miševa s potpunom resekcijom. (AD) Reprezentativne makroskopske slike rana nakon tri dana liječenja ne-antimikrobnim upravljačkim preljevom i srebrnim preljevom. (EH) Reprezentativni dijelovi rana obojeni hematoksilinom i eozinom. Kvantifikacija površine rane (I) i postotak reepitelizacije (j) izračunati su iz histoloških odjeljaka na sredini točke rane pomoću softvera za analizu slike (n = 11–12 po liječenoj skupini). Grafikoni prikazuju srednju +/- standardnu pogrešku. * znači p = <0,05.
Srebro ima dugu povijest korištenja kao antimikrobne terapije u zacjeljivanju rana, ali mnogo različitih formulacija i metoda isporuke mogu rezultirati razlikama u antimikrobnoj učinkovitosti 18. Nadalje, svojstva antibiofilma specifičnih sustava za isporuku srebra nisu u potpunosti shvaćena. Iako je imunološki odgovor domaćina relativno učinkovit protiv planktonskih bakterija, on je općenito manje učinkovit protiv biofilma19. Planktonske bakterije lako su fagocitozirane makrofazima, ali unutar biofilma, agregirane stanice predstavljaju dodatne probleme ograničavanjem odgovora domaćina u mjeri u kojoj imunološke stanice mogu proći apoptozu i oslobađaju protuupalne faktore kako bi poboljšali imunološki odgovor20. Primijećeno je da neki leukociti mogu prodrijeti u biofilme21, ali nisu u mogućnosti fagocitozne bakterije nakon što je ta obrana ugrožena22. Holistički pristup treba koristiti za podupiranje imunološkog odgovora domaćina protiv infekcije biofilma rana. Debrident rana može fizički poremetiti biofilm i ukloniti većinu bio -objekata, ali imunološki odgovor domaćina može biti neučinkovit protiv preostalog biofilma, pogotovo ako je imunološki odgovor domaćina ugrožen. Dakle, antimikrobne terapije poput srebrnih preljeva mogu podržati imunološki odgovor domaćina i eliminirati infekcije biofilma. Sastav, koncentracija, topljivost i supstrat isporuke mogu utjecati na antimikrobnu učinkovitost srebra. Posljednjih godina napredak u tehnologiji prerade srebra učinio je ove preljeve učinkovitijim 9,23. Kako tehnologija srebrnog odijevanja napreduje, važno je razumjeti učinkovitost ovih preljeva u kontroli infekcije rana i, što je još važnije, utjecaj ovih moćnih oblika srebra na okoliš rana i zacjeljivanja.
U ovom istraživanju uspoređivali smo učinkovitost dva napredna srebrna preljeva s konvencionalnim srebrnim preljevima koji proizvode Ag1+ ione protiv biofilma koristeći različite in vitro i in vivo modele. Također smo procijenili učinak ovih preljeva na okoliš rane i zacjeljivanje neovisno o infekciji. Kako bi se smanjio utjecaj matrice isporuke, svi testirani srebrni preljevi sastojali su se od karboksimetilceluloze.
Naša preliminarna procjena ovih srebrnih preljeva protiv kolonijalnih biofilma Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus pokazuje da su, za razliku od tradicionalnih preljeva Ag1+, dva napredna srebrna preljeva, Ag1++ EDTA/BC i kisika ag soli, učinkovite u 5. nekoliko dana. Osim toga, ovi preljevi sprječavaju ponovnu formaciju biofilma nakon ponovljenog izlaganja planktonskim bakterijama. Ag1+ preljev sadržavao je srebrni klorid, isti srebrni spoj i osnovna matrica kao AG1++ EDTA/BC, a imao je ograničen učinak na bakterijsku održivost unutar biofilma u istom razdoblju. Opažanje da je preljev Ag1++ EDTA/BC bio je učinkovitiji protiv biofilma od Ag1+ preljeva koji se sastoji od iste matrice, a srebrni spoj podržava ideju da su potrebni dodatni sastojci za povećanje učinkovitosti srebrnog klorida protiv biofilma, kao što je prijavljeno drugdje15. Ovi rezultati podržavaju ideju da BC i EDTA igraju dodatnu ulogu doprinoseći ukupnoj učinkovitosti odijevanja i da je odsutnost ove komponente u Ag1+ preljevima možda pridonijela neuspjehu pokazivanja in vitro učinkovitosti. Otkrili smo da preljevi od kisika AG koje proizvode ioni Ag2+ i Ag3+ pokazuju jaču antibakterijsku učinkovitost od Ag1+ i na razinama sličnim Ag1++ EDTA/BC. Međutim, zbog visokog redoks potencijala, nejasno je koliko dugo ioni Ag3+ ostaju aktivni i učinkoviti protiv biofilma rana i stoga zaslužuju daljnje proučavanje. Uz to, postoji mnogo različitih preljeva koji generiraju AG1+ ioni koji nisu testirani u ovoj studiji. Ovi preljevi sastoje se od različitih srebrnih spojeva, koncentracija i baznih matrica, što može utjecati na isporuku Ag1+ iona i njihovu učinkovitost protiv biofilma. Također je vrijedno napomenuti da postoje mnogo različitih in vitro i in vivo modela koji se koriste za procjenu učinkovitosti preljeva rana protiv biofilma. Vrsta korištenog modela, kao i sadržaj soli i proteina u medijima koji se koriste u ovim modelima, utjecat će na učinkovitost preljeva. U našem in vivo modelu dopustili smo da biofilm sazrijeva in vitro, a zatim ga prebacimo na dermalnu površinu rane. Imuni odgovor miša domaćina relativno je učinkovit protiv planktonske bakterije primijenjene na ranu, formirajući tako biofilm dok rana zacijeli. Dodavanje zrelog biofilma u ranu ograničava učinkovitost imunološkog odgovora domaćina na stvaranje biofilma omogućavajući zreli biofilm da se uspostavi unutar rane prije nego što zacjeljivanje može započeti. Dakle, naš model omogućava nam da procijenimo učinkovitost antimikrobnih preljeva na zrele biofilme prije nego što rane počnu zacjeljivati.
Otkrili smo i da presvlačenje utječe na učinkovitost srebrnih preljeva na in vitro uzgajane biofilme i svinjsku kožu. Bliski kontakt s ranom smatra se kritičnim za antimikrobnu učinkovitost svlačinja24,25. Preljevi koji sadrže ag soli s kisikom bili su u bliskom kontaktu sa zrelim biofilmima, što je rezultiralo značajnim smanjenjem broja održivih bakterija unutar biofilma nakon 24 sata. Suprotno tome, kada se tretira s Ag1+ i Ag1++ EDTA/BC preljevima, ostao je značajan broj održivih bakterija. Ovi preljevi sadrže šavove duž cijele dužine preljeva, što stvara mrtve prostore koji sprječavaju bliski kontakt s biofilmom. U našim in vitro studijama ta su nekontaktna područja spriječila ubojstvo održivih bakterija unutar biofilma. Procijenili smo bakterijsku održivost tek nakon 24 sata liječenja; S vremenom, kako preljev postaje zasićeniji, može biti manje mrtvog prostora, smanjujući područje za ove održive bakterije. Međutim, to ističe važnost sastava preljeva, a ne samo vrste srebra u preljevu.
Iako su studije in vitro korisne za usporedbu učinkovitosti različitih srebrnih tehnologija, također je važno razumjeti učinke ovih preljeva na biofilme in vivo, gdje tkivo domaćina i imunološki odgovori doprinose učinkovitosti preljeva protiv biofilma. Učinak ovih preljeva na biofilme rana primijećen je korištenjem skenirajuće elektronske mikroskopije i EPS bojenja biofilma pomoću unutarćelijskih i izvanstaničnih DNK boja. Otkrili smo da su nakon 3 dana liječenja svi preljevi bili učinkoviti u smanjenju DNK bez stanice u ranama zaraženim biofilmom, ali preljev AG1+ bio je manje učinkovit u ranama zaraženim Staphylococcus aureus. Skenirajuća elektronska mikroskopija također je pokazala da je znatno manje bakterija prisutno u ranama tretiranim srebrnim preljevima, iako je to bilo izraženije s preljevom od soli s kisikom i preljevom Ag1++ EDTA/BC u usporedbi s Ag1+ preljevom. Ovi podaci pokazuju da su testirani srebrni preljevi imali različit stupnjevi utjecaja na strukturu biofilma, ali nijedan od srebrnih preljeva nije mogao iskorijeniti biofilm, podupirući potrebu za holističkim pristupom liječenju infekcija biofilma rana; Upotreba srebrnih ručica. Liječenje prethodi fizičko debridman za uklanjanje većine biofilma.
Kronične rane često su u stanju teške upale, pri čemu su viška upalnih stanica ostale u ranom tkivu duže vrijeme, uzrokujući oštećenje tkiva i iscrpljujući kisik potreban za učinkovit stanični metabolizam i funkciju u rani26. Biofilmi pogoršavaju ovo neprijateljsko okruženje rana negativno utječući na zacjeljivanje na različite načine, uključujući inhibiciju stanične proliferacije i migracije i aktivaciju proupalnih citokina27. Kako srebrni preljevi postaju učinkovitiji, važno je razumjeti utjecaj koji imaju na okoliš rana i zacjeljivanje.
Zanimljivo je da, iako su svi srebrni preljevi utjecali na sastav biofilma, samo preljevi od srebrne soli u kisiku povećali su repitelizaciju tih zaraženih rana. Ovi podaci podržavaju naša prethodna otkrića17 i one iz Kalan i sur. (2017) 28, koji su pokazali dobru profile sigurnosti i toksičnosti srebrne soli s kisikom, jer su niže koncentracije srebra bile učinkovite protiv biofilma.
Naša trenutna studija naglašava razlike u srebrnoj tehnologiji između preljeva antimikrobnih srebra i utjecaja ove tehnologije na okoliš rana i zacjeljivanja neovisnog o infekciji. Međutim, ovi se rezultati razlikuju od prethodnih studija koje pokazuju da je Ag1 + + EDTA/BC preljev poboljšao ljekovite parametre ozlijeđenih zečjih ušiju in vivo. Međutim, to može biti posljedica razlika u životinjskim modelima, vremenima mjerenja i metodama primjene bakterija29. U ovom su slučaju mjerenja rana uzeta 12 dana nakon ozljede kako bi se omogućilo da aktivni sastojci preljeva djeluju na biofilm tijekom dužeg vremenskog razdoblja. To je podržano studijom koja je pokazala da su klinički zaraženi čir na nogama liječenim Ag1 + + EDTA/BC u početku porasli u veličini nakon tjedan dana liječenja, a zatim tijekom sljedeća 3 tjedna liječenja Ag1 + + EDTA/BC i u roku od 4 tjedna od 4 tjedna od 4 tjedna Upotreba neantimikrobnih podataka. droge. CMC preljevi za smanjenje veličine ulcera30.
Određeni oblici i koncentracije srebra ranije su se pokazali da su citotoksični in vitro 11, ali ti in vitro rezultati ne pretvaraju se uvijek u štetne učinke in vivo. Osim toga, napredak u srebrnoj tehnologiji i bolje razumijevanje srebrnih spojeva i koncentracija u preljevima doveli su do razvoja mnogih sigurnih i učinkovitih srebrnih preljeva. Međutim, kako tehnologija srebrnog odijevanja napreduje, važno je razumjeti utjecaj ovih preljeva na okoliš rana31,32,33. Prethodno je objavljeno da povećana stopa ponovne epitelizacije odgovara povećanom udjelu protuupalnih M2 makrofaga u usporedbi s proupalnim M1 fenotipom. To je zabilježeno u prethodnom modelu miša gdje su preljevi za rane od srebrnog hidrogela uspoređeni sa srebrnim sulfadiazinom i ne-antimimikrobnim hidrogelima34.
Kronične rane mogu pokazati pretjeranu upalu i primijećeno je da prisutnost viška neutrofila može biti štetna za zacjeljivanje rana35. U studiji na miševima iscrpljenim neutrofilom, prisutnost neutrofila odgojila je reepitelizaciju. Prisutnost viška neutrofila dovodi do visoke razine proteaza i reaktivnih vrsta kisika, poput superoksida i vodikovog peroksida, koji su povezani s kroničnim i sporo zacjeljujućim ranama37,38. Isto tako, povećanje broja makrofaga, ako je nekontrolirano, može dovesti do odgođenog zacjeljivanja rana39. Ovo povećanje je posebno važno ako makrofagi nisu u stanju prijeći iz protuupalnog fenotipa u prozapadni fenotip, što rezultira time da rane nisu uspjele izlaziti iz upalne faze izlječenja40. Primijetili smo smanjenje neutrofila i makrofaga u ranama zaraženim biofilmom nakon 3 dana liječenja svim srebrnim preljevima, ali smanjenje je bilo izraženije s preljevima od soli s kisikom. Ovo smanjenje može biti izravan rezultat imunološkog odgovora na srebro, odgovor na smanjeni bio -uzor ili rana u kasnijoj fazi zacjeljivanja, a samim tim imunološkim stanicama u smanjenju rane. Smanjenje broja upalnih stanica u rani može održati okoliš koji pogoduje zacjeljivanju rana. Mehanizam djelovanja načina na koji Ag Oxysalts promiče zacjeljivanje neovisno o infekciji nije jasan, ali sposobnost AG Oxysaltsa da proizvode kisik i uništavaju štetne razine vodikovog peroksida, posrednika upale, to može objasniti i zahtijeva daljnje studije17.
Kronične necjeljajuće zaražene rane predstavljaju problem i za liječnike i za pacijente. Iako mnogi preljevi tvrde da su antimikrobna učinkovitost, istraživanje se rijetko usredotočuje na druge ključne čimbenike koji utječu na mikrookolje rane. Ova studija pokazuje da različite srebrne tehnologije imaju različitu antimikrobnu učinkovitost i, što je još važnije, različite učinke na okoliš rana i zacjeljivanje, neovisno o infekciji. Iako ove in vitro i in vivo studije pokazuju učinkovitost ovih preljeva u liječenju infekcija rana i promicanja zacjeljivanja, potrebna su randomizirana kontrolirana ispitivanja kako bi se procijenila učinkovitost ovih preljeva u klinici.
Korištene skupove podataka i/ili analizirane tijekom trenutne studije dostupne su od odgovarajućeg autora na razumnu zahtjev.
Post Vrijeme: srpanj-15-2024