Hvala vam što ste posjetili nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo korištenje najnovije verzije preglednika (ili onemogućavanje načina kompatibilnosti u Internet Exploreru). Osim toga, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, ova stranica neće sadržavati stilove i JavaScript.
Skeletni mišić je heterogeno tkivo sastavljeno pretežno od miofibrila, koji se kod ljudi obično klasificiraju u tri tipa: jedan "spor" (tip 1) i dva "brza" (tipovi 2A i 2X). Međutim, heterogenost između i unutar tradicionalnih tipova miofibrila ostaje slabo shvaćena. Primijenili smo transkriptomske i proteomske pristupe na 1050, odnosno 1038 pojedinačnih miofibrila iz ljudskog vastus lateralisa. Proteomska studija uključivala je muškarce, a transkriptomska studija 10 muškaraca i 2 žene. Osim izoformi teškog lanca miozina, identificirali smo metaboličke proteine, ribosomske proteine i stanične spojne proteine kao izvore višedimenzionalne varijabilnosti intermiofibrila. Nadalje, unatoč identifikaciji nakupina sporih i brzih vlakana, naši podaci sugeriraju da se vlakna tipa 2X fenotipski ne razlikuju od drugih brzotrzajućih vlakana. Nadalje, klasifikacija temeljena na teškom lancu miozina nije dovoljna za opis fenotipa miofibrila kod nemalinskih miopatija. Sveukupno, naši podaci ukazuju na višedimenzionalnu heterogenost miofibrila, s izvorima varijacija koji se protežu izvan izoformi teškog lanca miozina.
Stanična heterogenost je inherentna značajka svih bioloških sustava, što stanicama omogućuje specijalizaciju kako bi zadovoljile različite potrebe tkiva i stanica.1 Tradicionalni pogled na heterogenost vlakana skeletnih mišića bio je da motorni neuroni definiraju tip vlakna unutar motorne jedinice i da je tip vlakna (tj. tip 1, tip 2A i tip 2X kod ljudi) određen karakteristikama izoformi teškog lanca miozina (MYH).2 To se u početku temeljilo na njihovoj nestabilnosti pH ATPaze,3,4 a kasnije na njihovoj molekularnoj ekspresiji MYH.5 Međutim, identifikacijom i naknadnim prihvaćanjem „mješovitih“ vlakana koja koeksprimiraju više MYH u različitim omjerima, vlakna skeletnih mišića sve se više promatraju kao kontinuum, a ne kao zasebne vrste vlakana.6 Unatoč tome, područje se još uvijek uvelike oslanja na MYH kao primarni klasifikator za klasifikaciju miofibera, stav vjerojatno pod utjecajem ograničenja i značajnih pristranosti ranih studija na glodavcima čiji se profili ekspresije MYH i raspon tipova vlakana razlikuju od onih kod ljudi.2 Situaciju dodatno komplicira činjenica da različiti ljudski skeletni mišići pokazuju raznolik raspon tipova vlakana.7 Vastus lateralis je miješani mišić sa srednjim (i stoga reprezentativnim) profilom ekspresije MYH.7 Nadalje, jednostavnost uzorkovanja čini ga najbolje proučenim mišićem kod ljudi.
Stoga je nepristrano istraživanje raznolikosti vlakana skeletnih mišića korištenjem moćnih „omics“ alata ključno, ali i izazovno, dijelom zbog višejezgrene prirode vlakana skeletnih mišića. Međutim, transkriptomske8,9 i proteomske10 tehnologije su posljednjih godina doživjele revoluciju u osjetljivosti zahvaljujući raznim tehnološkim napretcima, omogućujući analizu skeletnih mišića u rezoluciji pojedinačnih vlakana. Kao rezultat toga, postignut je značajan napredak u karakterizaciji raznolikosti pojedinačnih vlakana i njihovom odgovoru na atrofične podražaje i starenje11,12,13,14,15,16,17,18. Važno je da ovi tehnološki napreci imaju kliničku primjenu, omogućujući detaljniju i precizniju karakterizaciju disregulacije povezane s bolešću. Na primjer, patofiziologija nemalinske miopatije, jedne od najčešćih nasljednih mišićnih bolesti (MIM 605355 i MIM 161800), složena je i zbunjujuća.19,20 Stoga bi bolja karakterizacija disregulacije vlakana skeletnih mišića mogla dovesti do značajnog napretka u našem razumijevanju ove bolesti.
Razvili smo metode za transkriptomsku i proteomsku analizu pojedinačnih vlakana skeletnih mišića ručno izoliranih iz uzoraka ljudske biopsije i primijenili ih na tisuće vlakana, što nam je omogućilo istraživanje stanične heterogenosti vlakana ljudskih skeletnih mišića. Tijekom ovog rada pokazali smo moć transkriptomskog i proteomskog fenotipiziranja mišićnih vlakana i identificirali metaboličke, ribosomske i stanične spojne proteine kao značajne izvore varijabilnosti između vlakana. Nadalje, koristeći ovaj proteomski tijek rada, okarakterizirali smo kliničku relevantnost nematodne miopatije u pojedinačnim vlaknima skeletnih mišića, otkrivajući koordinirani pomak prema neoksidativnim vlaknima neovisno o tipu vlakana na temelju MYH.
Kako bismo istražili heterogenost ljudskih vlakana skeletnih mišića, razvili smo dva tijeka rada koji omogućuju analizu transkriptoma i proteoma pojedinačnih vlakana skeletnih mišića (slika 1A i dopunska slika 1A). Razvili smo i optimizirali nekoliko metodoloških koraka, od pohrane uzoraka i očuvanja integriteta RNA i proteina do optimizacije propusnosti za svaki pristup. Za analizu transkriptoma, to je postignuto umetanjem molekularnih barkodova specifičnih za uzorak u početnom koraku reverzne transkripcije, što je omogućilo objedinjavanje 96 vlakana za učinkovitu daljnju obradu. Dublje sekvenciranje (±1 milijun očitanja po vlaknu) u usporedbi s tradicionalnim pristupima pojedinačnih stanica dodatno je obogatilo podatke o transkriptomu.21 Za proteomiku smo koristili kratki kromatografski gradijent (21 minuta) u kombinaciji s DIA-PASEF akvizicijom podataka na timsTOF masenom spektrometru kako bismo optimizirali dubinu proteoma uz održavanje visoke propusnosti. 22,23 Kako bismo istražili heterogenost zdravih vlakana skeletnih mišića, karakterizirali smo transkriptome 1050 pojedinačnih vlakana od 14 zdravih odraslih donora i proteome 1038 vlakana od 5 zdravih odraslih donora (Dodatna tablica 1). U ovom radu, ovi skupovi podataka nazivaju se transkriptomi od 1000 vlakana, odnosno proteomi. Naš pristup otkrio je ukupno 27 237 transkripata i 2983 proteina u transkriptomskoj i proteomskoj analizi od 1000 vlakana (Slika 1A, Dodatni skupovi podataka 1–2). Nakon filtriranja transkriptomskih i proteomskih skupova podataka za >1000 detektiranih gena i 50% valjanih vrijednosti po vlaknu, provedene su naknadne bioinformatičke analize za 925 i 974 vlakana u transkriptomu, odnosno proteomu. Nakon filtriranja, u prosjeku je detektirano 4257 ± 1557 gena i 2015 ± 234 proteina (prosjek ± SD) po vlaknu, s ograničenom interindividualnom varijabilnosti (Dopunske slike 1B–C, Dopunski skupovi podataka 3–4). Međutim, varijabilnost unutar ispitanika bila je izraženija među sudionicima, vjerojatno zbog razlika u prinosu RNA/proteina između vlakana različitih duljina i površina poprečnog presjeka. Za većinu proteina (>2000), koeficijent varijacije bio je ispod 20% (Dopunska slika 1D). Obje metode omogućile su snimanje širokog dinamičkog raspona transkripata i proteina s visoko izraženim potpisima važnim za kontrakciju mišića (npr. ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Dopunske slike 1E–F). Većina identificiranih značajki bila je zajednička između transkriptomskih i proteomskih skupova podataka (Dopunska slika 1G), a srednji intenziteti UMI/LFQ ovih značajki bili su razumno dobro korelirani (r = 0,52) (Dopunska slika 1H).
Tijek rada za transkriptomiku i proteomiku (izrađen pomoću BioRender.com). BD Krivulje dinamičkog raspona za MYH7, MYH2 i MYH1 te izračunati pragovi za dodjeljivanje tipa vlakana. E, F Raspodjela ekspresije MYH po vlaknima u skupovima podataka za transkriptomiku i proteomiku. G, H Grafikoni aproksimacije i projekcije ujednačene raznolikosti (UMAP) za transkriptomiku i proteomiku obojeni prema tipu vlakana temeljenom na MYH. I, J Grafikoni značajki koji prikazuju ekspresiju MYH7, MYH2 i MYH1 u skupovima podataka za transkriptomiku i proteomiku.
U početku smo krenuli dodijeliti tip vlakana temeljen na MYH-u svakom vlaknu koristeći optimizirani pristup koji iskorištava visoku osjetljivost i dinamički raspon ekspresije MYH-a u omics skupovima podataka. Prethodne studije koristile su proizvoljne pragove za označavanje vlakana kao čista tipa 1, tipa 2A, tipa 2X ili miješana na temelju fiksnog postotka ekspresije različitih MYH-ova11,14,24. Koristili smo drugačiji pristup u kojem je ekspresija svakog vlakna rangirana prema MYH-ovima koje smo koristili za tipizaciju vlakana: MYH7, MYH2 i MYH1, što odgovara vlaknima tipa 1, tipa 2A i tipa 2X. Zatim smo matematički izračunali donju točku infleksije svake rezultirajuće krivulje i koristili je kao prag za dodjeljivanje vlakana kao pozitivnih (iznad praga) ili negativnih (ispod praga) za svaki MYH (Slika 1B–D). Ovi podaci pokazuju da MYH7 (Slika 1B) i MYH2 (Slika 1C) imaju izraženije on/off profile ekspresije na razini RNA u usporedbi s razinom proteina. Doista, na razini proteina, vrlo malo vlakana nije eksprimiralo MYH7, a nijedno vlakno nije imalo 100% ekspresiju MYH2. Zatim smo upotrijebili unaprijed određene pragove ekspresije kako bismo svim vlaknima u svakom skupu podataka dodijelili tipove vlakana temeljene na MYH. Na primjer, vlakna MYH7+/MYH2-/MYH1- dodijeljena su tipu 1, dok su vlakna MYH7-/MYH2+/MYH1+ dodijeljena miješanom tipu 2A/2X (za puni opis pogledajte Dodatnu tablicu 2). Združivanjem svih vlakana uočili smo izrazito sličnu distribuciju tipova vlakana temeljenih na MYH i na razini RNA (Slika 1E) i proteina (Slika 1F), dok se relativni sastav tipova vlakana temeljenih na MYH razlikovao među pojedincima, što se i očekivalo (Dodatna slika 2A). Većina vlakana klasificirana je ili kao čisti tip 1 (34–35%) ili tip 2A (36–38%), iako je otkriven i značajan broj miješanih vlakana tipa 2A/2X (16–19%). Upečatljiva razlika je u tome što se čista vlakna tipa 2X mogu detektirati samo na razini RNA, ali ne i na razini proteina, što sugerira da je brza ekspresija MYH barem djelomično regulirana posttranskripcijski.
Validirali smo našu metodu tipizacije MYH vlakana temeljenu na proteomici korištenjem dot blottinga temeljenog na antitijelima, a obje metode postigle su 100%-tno slaganje u identifikaciji čistih vlakana tipa 1 i tipa 2A (vidi Dodatnu sliku 2B). Međutim, pristup temeljen na proteomici bio je osjetljiviji, učinkovitiji u identifikaciji miješanih vlakana i kvantificiranju udjela svakog MYH gena u svakom vlaknu. Ovi podaci pokazuju učinkovitost korištenja objektivnog, visoko osjetljivog omics pristupa za karakterizaciju tipova vlakana skeletnih mišića.
Zatim smo koristili kombinirane informacije dobivene transkriptomikom i proteomikom kako bismo objektivno klasificirali miofibre na temelju njihovog potpunog transkriptoma ili proteoma. Koristeći metodu aproksimacije i projekcije uniformne mnogostrukosti (UMAP) za smanjenje dimenzionalnosti na šest glavnih komponenti (Dopunske slike 3A–B), uspjeli smo vizualizirati varijabilnost miofibre u transkriptomu (Slika 1G) i proteomu (Slika 1H). Važno je napomenuti da miofibre nisu grupirane prema sudionicima (Dopunske slike 3C–D) ili danima testiranja (Dopunska slika 3E) ni u transkriptomskim ni u proteomskim skupovima podataka, što sugerira da je varijabilnost unutar ispitanika u vlaknima skeletnih mišića veća od varijabilnosti između ispitanika. Na UMAP dijagramu pojavila su se dva različita klastera koja predstavljaju „brza“ i „spora“ miofibre (Slike 1G–H). MYH7+ (spora) miofiberi bili su grupirani na pozitivnom polu UMAP1, dok su MYH2+ i MYH1+ (brza) miofiberi bili grupirani na negativnom polu UMAP1 (slike 1I–J). Međutim, nije napravljena razlika između tipova vlakana s brzim trzanjem (tj. tip 2A, tip 2X ili miješani 2A/2X) na temelju ekspresije MYH, što sugerira da ekspresija MYH1 (slika 1I–J) ili drugih klasičnih 2X miofibera poput ACTN3 ili MYLK2 (dopunske slike 4A–B) ne razlikuje različite tipove miofibera kada se razmatra cijeli transkriptom ili proteom. Štoviše, u usporedbi s MYH2 i MYH7, malo transkripata ili proteina bilo je pozitivno korelirano s MYH1 (dopunske slike 4C–H), što sugerira da brojnost MYH1 ne odražava u potpunosti transkriptom/proteom miofibera. Slični zaključci postignuti su pri procjeni miješane ekspresije triju MYH izoformi na UMAP razini (Dopunske slike 4I–J). Dakle, dok se 2X vlakna mogu identificirati na razini transkripta samo na temelju kvantifikacije MYH, MYH1+ vlakna se ne razlikuju od drugih brzih vlakana kada se razmatra cijeli transkriptom ili proteom.
Kao početno istraživanje heterogenosti sporih vlakana izvan MYH-a, procijenili smo četiri utvrđena proteina specifična za tip sporih vlakana: TPM3, TNNT1, MYL3 i ATP2A22. Podtipovi sporih vlakana pokazali su visoke, iako ne savršene, Pearsonove korelacije s MYH7 i u transkriptomici (Dodatna slika 5A) i proteomici (Dodatna slika 5B). Otprilike 25% i 33% sporih vlakana nije klasificirano kao čista spora vlakna prema svim podtipovima gena/proteina u transkriptomici (Dodatna slika 5C) odnosno proteomici (Dodatna slika 5D). Stoga, klasifikacija sporih vlakana na temelju više podtipova gena/proteina uvodi dodatnu složenost, čak i za proteine za koje se zna da su specifični za tip vlakana. To sugerira da klasifikacija vlakana na temelju izoformi jedne obitelji gena/proteina možda ne odražava adekvatno stvarnu heterogenost vlakana skeletnih mišića.
Kako bismo dalje istražili fenotipsku varijabilnost ljudskih skeletnih mišićnih vlakana na skali cijelog omics modela, proveli smo nepristranu redukciju dimenzionalnosti podataka pomoću analize glavnih komponenti (PCA) (Slika 2A). Slično UMAP dijagramima, ni sudionik ni dan testiranja nisu utjecali na grupiranje vlakana na razini PCA (Dopunske slike 6A–C). U oba skupa podataka, tip vlakana temeljen na MYH-u objašnjen je pomoću PC2, koji je pokazao skup sporotrzajnih vlakana tipa 1 i drugi skup koji sadrži brzotrzajna vlakna tipa 2A, tipa 2X i miješana 2A/2X vlakna (Slika 2A). U oba skupa podataka, ova dva klastera bila su povezana malim brojem miješanih vlakana tipa 1/2A. Kao što se i očekivalo, analiza prekomjerne zastupljenosti glavnih PC pokretača potvrdila je da je PC2 pokretan kontraktilnim i metaboličkim potpisima (Slika 2B i Dopunske slike 6D–E, Dopunski skupovi podataka 5–6). Sveukupno, utvrđeno je da je tip vlakana temeljen na MYH dovoljan za objašnjenje kontinuirane varijacije duž PC2, s izuzetkom takozvanih 2X vlakana koja su bila raspoređena po cijelom transkriptomu unutar brzog klastera.
A. Grafikoni analize glavnih komponenti (PCA) skupova podataka transkriptoma i proteoma obojeni prema vrsti vlakna na temelju MYH. B. Analiza obogaćivanja transkriptnih i proteinskih pokretača u PC2 i PC1. Statistička analiza provedena je korištenjem paketa clusterProfiler i p-vrijednosti prilagođenih Benjamini-Hochbergu. C, D. PCA grafovi obojeni prema terminima ontologije gena međustanične adhezije (GO) u transkriptomu i GO terminima kostamera u proteomu. Strelice predstavljaju transkriptne i proteinske pokretače i njihove smjerove. E, F. Grafikoni aproksimacije i projekcije uniformne mnogostrukosti (UMAP) prikazuju klinički relevantne značajke koje prikazuju gradijente ekspresije neovisno o vrsti sporih/brzih vlakana. G, H. Korelacije između PC2 i PC1 pokretača u transkriptomima i proteomima.
Neočekivano, tip miofibrila temeljen na MYH-u objasnio je samo drugi najveći stupanj varijabilnosti (PC2), što sugerira da drugi biološki čimbenici koji nisu povezani s tipom miofibrila temeljenim na MYH-u (PC1) igraju važnu ulogu u regulaciji heterogenosti vlakana skeletnih mišića. Analiza prekomjerne zastupljenosti glavnih pokretača u PC1 otkrila je da je varijabilnost u PC1 prvenstveno određena stanično-staničnom adhezijom i sadržajem ribosoma u transkriptomu, te kostamerama i ribosomskim proteinima u proteomu (slika 2B i dopunske slike 6D–E, dodatni skup podataka 7). U skeletnim mišićima, kostameri povezuju Z-disk sa sarkolemom i uključeni su u prijenos sile i signalizaciju. 25 Označeni PCA dijagrami koji koriste značajke stanično-stanične adhezije (transkriptom, slika 2C) i kostamera (proteom, slika 2D) otkrili su snažan pomak ulijevo u PC1, što ukazuje na to da su te značajke obogaćene određenim vlaknima.
Detaljnijim ispitivanjem grupiranja miofibera na UMAP razini otkriveno je da većina značajki pokazuje gradijent ekspresije temeljen na MYH-u neovisan o tipu miofibera, a ne specifičan za podgrupe miofibera. Ovaj kontinuitet uočen je za nekoliko gena povezanih s patološkim stanjima (Slika 2E), kao što su CHCHD10 (neuromuskularna bolest), SLIT3 (atrofija mišića), CTDNEP1 (bolest mišića). Ovaj kontinuitet uočen je i u cijelom proteomu, uključujući proteine povezane s neurološkim poremećajima (UGDH), inzulinskom signalizacijom (PHIP) i transkripcijom (HIST1H2AB) (Slika 2F). Zajedno, ovi podaci ukazuju na kontinuitet u heterogenosti sporog/brzog trzaja neovisnoj o tipu vlakana u različitim miofiberima.
Zanimljivo je da su upravljački geni u PC2 pokazali dobru korelaciju transkriptoma i proteoma (r = 0,663) (Slika 2G), što sugerira da su tipovi vlakana sa sporim i brzim trzajem, a posebno kontraktilna i metabolička svojstva vlakana skeletnih mišića, transkripcijski regulirani. Međutim, upravljački geni u PC1 nisu pokazali korelaciju transkriptoma i proteoma (r = -0,027) (Slika 2H), što sugerira da su varijacije koje nisu povezane sa tipovima vlakana sa sporim/brzim trzajem uglavnom regulirane posttranskripcijski. Budući da su varijacije u PC1 prvenstveno objašnjene terminima ontologije ribosomskih gena, a s obzirom na to da ribosomi igraju ključnu i specijaliziranu ulogu u stanici aktivnim sudjelovanjem i utjecajem na translaciju proteina,31 zatim smo krenuli istražiti ovu neočekivanu heterogenost ribosoma.
Prvo smo obojali dijagram proteomske analize glavnih komponenti prema relativnoj zastupljenosti proteina u GOCC terminu "citoplazmatski ribosom" (slika 3A). Iako je ovaj termin obogaćen na pozitivnoj strani PC1, što rezultira malim gradijentom, ribosomski proteini pokreću particioniranje u oba smjera PC1 (slika 3A). Ribosomski proteini obogaćeni na negativnoj strani PC1 uključivali su RPL18, RPS18 i RPS13 (slika 3B), dok su RPL31, RPL35 i RPL38 (slika 3C) bili glavni pokretači na pozitivnoj strani PC1. Zanimljivo je da su RPL38 i RPS13 bili visoko eksprimirani u skeletnim mišićima u usporedbi s drugim tkivima (dodatna slika 7A). Ovi prepoznatljivi ribosomski potpisi u PC1 nisu uočeni u transkriptomu (dodatna slika 7B), što ukazuje na posttranskripcijsku regulaciju.
A. Grafikon analize glavnih komponenti (PCA) obojen prema terminima citoplazmatske ribosomske genske ontologije (GO) preko proteoma. Strelice pokazuju smjer varijacija posredovanih proteinima na PCA grafu. Duljina linije odgovara rezultatu glavne komponente za određeni protein. B, C. PCA grafički prikazi značajki za RPS13 i RPL38. D. Nenadzirana hijerarhijska analiza klasteriranja citoplazmatskih ribosomskih proteina. E. Strukturni model 80S ribosoma (PDB: 4V6X) koji ističe ribosomske proteine s različitom zastupljenošću u vlaknima skeletnih mišića. F. Ribosomski proteini s različitom stehiometrijom lokaliziranim u blizini izlaznog kanala mRNA.
Koncepti ribosomske heterogenosti i specijalizacije već su ranije predloženi, pri čemu prisutnost različitih subpopulacija ribosoma (ribosomska heterogenost) može izravno utjecati na translaciju proteina u različitim tkivima32 i stanicama33 putem selektivne translacije specifičnih skupova mRNA transkripata34 (specijalizacija ribosoma). Kako bismo identificirali subpopulacije ribosomskih proteina koji se koeksprimiraju u vlaknima skeletnih mišića, proveli smo nenadziranu hijerarhijsku analizu klasteriranja ribosomskih proteina u proteomu (Slika 3D, Dodatni skup podataka 8). Kao što se i očekivalo, ribosomski proteini nisu se grupirali prema vrsti vlakana na temelju MYH. Međutim, identificirali smo tri različita klastera ribosomskih proteina; prvi klaster (ribosomski_klaster_1) je koreguliran s RPL38 i stoga ima povećanu ekspresiju u vlaknima s pozitivnim PC1 profilom. Drugi klaster (ribosomski_klaster_2) je koreguliran s RPS13 i povišen je u vlaknima s negativnim PC1 profilom. Treći klaster (ribosomski_klaster_3) ne pokazuje koordiniranu diferencijalnu ekspresiju u vlaknima skeletnih mišića i može se smatrati "jezgrom" ribosomskog proteina skeletnih mišića. Oba ribosomska klastera 1 i 2 sadrže ribosomske proteine za koje je prethodno pokazano da reguliraju alternativnu translaciju (npr. RPL10A, RPL38, RPS19 i RPS25) i funkcionalno utječu na razvoj (npr. RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 U skladu s rezultatima PCA, uočena heterogena zastupljenost ovih ribosomskih proteina u vlaknima također je pokazala kontinuitet (Dodatna slika 7C).
Kako bismo vizualizirali položaj heterogenih ribosomskih proteina unutar ribosoma, koristili smo strukturni model ljudskog 80S ribosoma (Protein Data Bank: 4V6X) (Slika 3E). Nakon izolacije ribosomskih proteina koji pripadaju različitim ribosomskim klasterima, njihovi položaji nisu bili usko usklađeni, što sugerira da naš pristup nije uspio osigurati obogaćivanje određenih regija/frakcija ribosoma. Zanimljivo je, međutim, da je udio proteina velikih podjedinica u klasteru 2 bio niži nego u klasterima 1 i 3 (Dodatna slika 7D). Uočili smo da su proteini s promijenjenom stehiometrijom u vlaknima skeletnih mišića pretežno lokalizirani na površini ribosoma (Slika 3E), što je u skladu s njihovom sposobnošću interakcije s elementima unutarnjeg mjesta ulaska ribosoma (IRES) u različitim populacijama mRNA, čime koordiniraju selektivnu translaciju. 40, 41 Nadalje, mnogi proteini s promijenjenom stehiometrijom u vlaknima skeletnih mišića bili su smješteni u blizini funkcionalnih regija kao što je izlazni tunel mRNA (Slika 3F), koji selektivno reguliraju translacijsko produljenje i zaustavljanje specifičnih peptida. 42 Ukratko, naši podaci upućuju na to da stehiometrija ribosomskih proteina skeletnih mišića pokazuje heterogenost, što rezultira razlikama između vlakana skeletnih mišića.
Zatim smo krenuli identificirati potpise brzih i sporih vlakana i istražiti mehanizme njihove transkripcijske regulacije. Uspoređujući klastere brzih i sporih vlakana definirane UMAP-om u dva skupa podataka (slike 1G–H i 4A–B), transkriptomske i proteomske analize identificirale su 1366 odnosno 804 različito zastupljena obilježja (slike 4A–B, dodatni skupovi podataka 9–12). Uočili smo očekivane razlike u potpisima povezanim sa sarkomerima (npr. tropomiozin i troponin), spajanjem ekscitacije i kontrakcije (SERCA izoforme) i metabolizmom energije (npr. ALDOA i CKB). Štoviše, transkripti i proteini koji reguliraju ubikvitinaciju proteina bili su različito eksprimirani u brzim i sporim vlaknima (npr. USP54, SH3RF2, USP28 i USP48) (slike 4A–B). Štoviše, gen mikrobnog proteina RP11-451G4.2 (DWORF), za koji je prethodno pokazano da se diferencijalno eksprimira u različitim tipovima mišićnih vlakana janjetine43 i pojačava aktivnost SERCA u srčanom mišiću44, bio je značajno pojačan u sporim skeletnim mišićnim vlaknima (Slika 4A). Slično tome, na razini pojedinačnih vlakana, uočene su značajne razlike u poznatim potpisima kao što su izoforme laktat dehidrogenaze povezane s metabolizmom (LDHA i LDHB, Slika 4C i Dopunska slika 8A)45,46 kao i prethodno nepoznati potpisi specifični za tip vlakana (kao što su IRX3, USP54, USP28 i DPYSL3) (Slika 4C). Postojalo je značajno preklapanje diferencijalno eksprimiranih značajki između transkriptomskih i proteomskih skupova podataka (Dopunska slika 8B), kao i korelacija promjene nagiba uzrokovana uglavnom izraženijom diferencijalnom ekspresijom značajki sarkomera (Dopunska slika 8C). Značajno je da su neki potpisi (npr. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) pokazali snažnu posttranskripcijsku regulaciju samo na proteomskoj razini i imali su specifične profile ekspresije za tip vlakana sporog/brzog trzanja (dodatna slika 8C).
A i B vulkanski dijagrami uspoređuju spore i brze klastere identificirane dijagramima uniformne mnogostruke aproksimacije i projekcije (UMAP) na slikama 1G–H. Obojene točke predstavljaju transkripte ili proteine koji se značajno razlikuju pri FDR < 0,05, a tamnije točke predstavljaju transkripte ili proteine koji se značajno razlikuju pri logaritamskoj promjeni > 1. Dvosmjerna statistička analiza provedena je korištenjem DESeq2 Wald testa s Benjamini-Hochberg prilagođenim p-vrijednostima (transkriptomika) ili Limma metodom linearnog modela s empirijskom Bayesovom analizom nakon čega slijedi Benjamini-Hochberg prilagodba za višestruke usporedbe (proteomika). C Grafikoni potpisa odabranih različito eksprimiranih gena ili proteina između sporih i brzih vlakana. D Analiza obogaćivanja značajno različito eksprimiranih transkripata i proteina. Vrijednosti koje se preklapaju obogaćene su u oba skupa podataka, vrijednosti transkriptoma obogaćene su samo u transkriptomu, a vrijednosti proteoma obogaćene su samo u proteomu. Statistička analiza provedena je korištenjem clusterProfiler paketa s Benjamini-Hochberg prilagođenim p-vrijednostima. E. Transkripcijski faktori specifični za tip vlakana identificirani SCENIC-om na temelju SCENIC-ovih rezultata specifičnosti regulatora i diferencijalne ekspresije mRNA između tipova vlakana. F. Profiliranje odabranih transkripcijskih faktora diferencijalno eksprimiranih između sporih i brzih vlakana.
Zatim smo proveli analizu prekomjerne zastupljenosti različito zastupljenih gena i proteina (Slika 4D, Dodatni skup podataka 13). Obogaćivanje puta za značajke koje su se razlikovale između dva skupa podataka otkrilo je očekivane razlike, kao što su procesi β-oksidacije masnih kiselina i metabolizma ketona (spora vlakna), kontrakcija miofilamenata/mišića (brza i spora vlakna) i katabolički procesi ugljikohidrata (brza vlakna). Aktivnost serin/treonin protein fosfataze također je bila povišena u brzim vlaknima, potaknuta značajkama kao što su regulatorne i katalitičke podjedinice fosfataze (PPP3CB, PPP1R3D i PPP1R3A), za koje se zna da reguliraju metabolizam glikogena (47) (Dodatne slike 8D–E). Drugi putevi obogaćeni brzim vlaknima uključivali su procesna (P-) tijela (YTHDF3, TRIM21, LSM2) u proteomu (dodatna slika 8F), potencijalno uključena u posttranskripcijsku regulaciju (48), i aktivnost transkripcijskih faktora (SREBF1, RXRG, RORA) u transkriptomu (dodatna slika 8G). Spora vlakna bila su obogaćena aktivnošću oksidoreduktaze (BDH1, DCXR, TXN2) (dodatna slika 8H), vezanjem amida (CPTP, PFDN2, CRYAB) (dodatna slika 8I), izvanstaničnom matriksom (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (dodatna slika 8J) i aktivnošću receptor-ligand (FNDC5, SPX, NENF) (dodatna slika 8K).
Kako bismo dobili daljnji uvid u transkripcijsku regulaciju koja leži u osnovi karakteristika tipova sporih/brzih mišićnih vlakana, proveli smo analizu obogaćivanja transkripcijskih faktora pomoću SCENIC49 (Dodatni skup podataka 14). Mnogi transkripcijski faktori bili su značajno obogaćeni između brzih i sporih mišićnih vlakana (Slika 4E). To je uključivalo transkripcijske faktore poput MAFA, koji je prethodno povezan s razvojem brzih mišićnih vlakana,50 kao i nekoliko transkripcijskih faktora koji prethodno nisu bili povezani s genskim programima specifičnim za tip mišićnih vlakana. Među njima, PITX1, EGR1 i MYF6 bili su najobogaćeniji transkripcijski faktori u brzim mišićnim vlaknima (Slika 4E). Nasuprot tome, ZSCAN30 i EPAS1 (također poznat kao HIF2A) bili su najobogaćeniji transkripcijski faktori u sporim mišićnim vlaknima (Slika 4E). U skladu s tim, MAFA je bio eksprimiran na višim razinama u UMAP regiji koja odgovara brzim mišićnim vlaknima, dok je EPAS1 imao suprotan obrazac ekspresije (Slika 4F).
Uz poznate gene koji kodiraju proteine, postoje brojni biotipovi nekodirajućih RNA koji mogu biti uključeni u regulaciju ljudskog razvoja i bolesti. 51, 52 U transkriptomskim skupovima podataka, nekoliko nekodirajućih RNA pokazuje specifičnost za tip vlakana (slika 5A i dodatni skup podataka 15), uključujući LINC01405, koja je vrlo specifična za spora vlakna i za koju se navodi da je smanjena u mišićima kod pacijenata s mitohondrijskom miopatijom. 53 Nasuprot tome, RP11-255P5.3, koji odgovara genu lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, pokazuje specifičnost za tip brzih vlakana. I LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) i RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) pokazuju specifičnost za skeletne mišiće (dodatne slike 9A–B) i nemaju poznate kontraktilne gene unutar svog genomskog susjedstva od 1 Mb, što sugerira da igraju specijaliziranu ulogu u regulaciji tipova vlakana, a ne u regulaciji susjednih kontraktilnih gena. Profili ekspresije specifični za tip sporih/brzih vlakana LINC01405 i RP11-255P5.3 potvrđeni su pomoću RNAscope-a (slike 5B–C).
A. Nekodirajući RNA transkripti značajno su regulirani u sporim i brzim mišićnim vlaknima. B. Reprezentativne RNAskopske slike koje prikazuju specifičnost tipova sporih i brzih vlakana LINC01405 i RP11-255P5.3. Mjerilo = 50 μm. C. Kvantifikacija ekspresije nekodirajuće RNA specifične za tip miofibrila određena RNAskopom (n = 3 biopsije od neovisnih pojedinaca, uspoređujući brza i spora mišićna vlakna unutar svake osobe). Statistička analiza provedena je korištenjem dvostranog Studentovog t-testa. Okvirni dijagrami prikazuju medijan te prvi i treći kvartil, s viskijima koji pokazuju na minimalne i maksimalne vrijednosti. D. De novo tijek rada za identifikaciju mikrobnih proteina (kreiran pomoću BioRender.com). E. Mikrobni protein LINC01405_ORF408:17441:17358 specifično se eksprimira u sporim skeletnim mišićnim vlaknima (n = 5 biopsija od neovisnih sudionika, uspoređujući brza i spora mišićna vlakna kod svakog sudionika). Statistička analiza provedena je korištenjem Limmove metode linearnog modela u kombinaciji s empirijskim Bayesovim pristupom, a zatim Benjamini-Hochbergove metode za višestruke usporedbe s prilagodbom p-vrijednosti. Okvirni dijagrami prikazuju medijan, prvi i treći kvartil, s viskijima koji pokazuju na maksimalne/minimalne vrijednosti.
Nedavne su studije pokazale da mnogi pretpostavljeni nekodirajući transkripti kodiraju transkribirane mikrobne proteine, od kojih neki reguliraju funkciju mišića. 44, 55 Kako bismo identificirali mikrobne proteine s potencijalnom specifičnošću za tip vlakana, pretražili smo naš skup podataka o proteomu od 1000 vlakana koristeći prilagođenu FASTA datoteku koja sadrži sekvence nekodirajućih transkripata (n = 305) pronađenih u skupu podataka o transkriptomu od 1000 vlakana (slika 5D). Identificirali smo 197 mikrobnih proteina iz 22 različita transkripta, od kojih je 71 bio različito reguliran između sporih i brzih vlakana skeletnih mišića (dodatna slika 9C i dodatni skup podataka 16). Za LINC01405 identificirana su tri produkta mikrobnih proteina, od kojih je jedan pokazao sličnu specifičnost za spora vlakna kao i njegov transkript (slika 5E i dodatna slika 9D). Stoga smo identificirali LINC01405 kao gen koji kodira mikrobni protein specifičan za spora vlakna skeletnih mišića.
Razvili smo sveobuhvatan tijek rada za proteomsku karakterizaciju pojedinačnih mišićnih vlakana velikih razmjera i identificirali regulatore heterogenosti vlakana u zdravim stanjima. Primijenili smo ovaj tijek rada kako bismo razumjeli kako nemalinske miopatije utječu na heterogenost vlakana skeletnih mišića. Nemalinske miopatije su nasljedne mišićne bolesti koje uzrokuju slabost mišića i, kod pogođene djece, prezentiraju se nizom komplikacija, uključujući respiratorne poteškoće, skoliozu i ograničenu pokretljivost udova. 19,20 Tipično, kod nemalinskih miopatija, patogene varijante u genima kao što je aktin alfa 1 (ACTA1) rezultiraju prevladavanjem sastava miofibrila sa sporim trzanjem, iako je taj učinak heterogen. Jedna značajna iznimka je troponin T1 nemalinska miopatija (TNNT1), koja ima prevladavanje brzih vlakana. Stoga, bolje razumijevanje heterogenosti koja je u osnovi disregulacije vlakana skeletnih mišića uočene kod nemalinskih miopatija može pomoći u razotkrivanju složenog odnosa između tih bolesti i tipa miofibrila.
U usporedbi sa zdravim kontrolnim skupinama (n=3 po skupini), miofibrile izolirane od pacijenata s nemalinskom miopatijom s mutacijama u genima ACTA1 i TNNT1 pokazale su izraženu atrofiju ili distrofiju miofibrila (Slika 6A, Dodatna tablica 3). To je predstavljalo značajne tehničke izazove za proteomsku analizu zbog ograničene količine dostupnog materijala. Unatoč tome, uspjeli smo detektirati 2485 proteina u 272 skeletna miofibrila. Nakon filtriranja najmanje 1000 kvantificiranih proteina po vlaknu, 250 vlakana podvrgnuto je naknadnoj bioinformatičkoj analizi. Nakon filtriranja, kvantificirano je u prosjeku 1573 ± 359 proteina po vlaknu (Dodatna slika 10A, Dodatni skupovi podataka 17–18). Značajno je da je, unatoč značajnom smanjenju veličine vlakana, dubina proteoma uzoraka pacijenata s nemalinskom miopatijom samo blago smanjena. Štoviše, obrada ovih podataka pomoću vlastitih FASTA datoteka (uključujući nekodirajuće transkripte) omogućila nam je identifikaciju pet mikrobnih proteina u skeletnim miofibrima pacijenata s nemalinskom miopatijom (Dodatni skup podataka 19). Dinamički raspon proteoma bio je značajno širi, a ukupni proteini u kontrolnoj skupini dobro su korelirali s rezultatima prethodne analize proteoma s 1000 vlakana (Dodatna slika 10B–C).
A. Mikroskopske slike koje prikazuju atrofiju ili distrofiju vlakana i prevlast različitih tipova vlakana na temelju MYH kod ACTA1 i TNNT1 nemalinskih miopatija (NM). Mjerilo = 100 μm. Kako bi se osigurala ponovljivost bojenja kod ACTA1 i TNNT1 pacijenata, tri biopsije pacijenata obojene su dva do tri puta (četiri presjeka po slučaju) prije odabira reprezentativnih slika. B. Udjeli tipova vlakana kod sudionika na temelju MYH. C. Grafikon analize glavnih komponenti (PCA) skeletnih mišićnih vlakana kod pacijenata s nemalinskim miopatijama i kontrolne skupine. D. Skeletna mišićna vlakna pacijenata s nemalinskim miopatijama i kontrolne skupine projicirana na PCA graf određen iz 1000 analiziranih vlakana na slici 2. Na primjer, vulkanski grafovi koji uspoređuju razlike između sudionika s ACTA1 i TNNT1 nemalinskim miopatijama i kontrolne skupine te između sudionika s ACTA1 i TNNT1 nemalinskim miopatijama. Obojeni krugovi označavaju proteine koji su se značajno razlikovali pri π < 0,05, a tamne točke označavaju proteine koji su se značajno razlikovali pri FDR < 0,05. Statistička analiza provedena je korištenjem metode linearnog modela Limma i empirijskih Bayesovih metoda, nakon čega je slijedila prilagodba p-vrijednosti za višestruke usporedbe korištenjem Benjamini-Hochbergove metode. H. Analiza obogaćivanja značajno različito eksprimiranih proteina u cijelom proteomu i u vlaknima tipa 1 i 2A. Statistička analiza provedena je korištenjem paketa clusterProfiler i Benjamini-Hochbergom prilagođenih p-vrijednosti. I, J. Grafikoni analize glavnih komponenti (PCA) obojeni terminima izvanstanične matrice i mitohondrijske genske ontologije (GO).
Budući da nemalinske miopatije mogu utjecati na udio tipova miofibera koji eksprimiraju MYH u skeletnim mišićima,19,20 prvo smo ispitali tipove miofibera koji eksprimiraju MYH kod pacijenata s nemalinskim miopatijama i kontrolne skupine. Tip miofibera odredili smo nepristranom metodom prethodno opisanom za test s 1000 miofibera (dodatne slike 10D–E) i ponovno nismo uspjeli identificirati čista 2X miofibera (slika 6B). Uočili smo heterogeni učinak nemalinskih miopatija na tip miofibera, budući da su dva pacijenta s mutacijama ACTA1 imala povećan udio miofibera tipa 1, dok su dva pacijenta s TNNT1 nemalinskom miopatijom imala smanjen udio miofibera tipa 1 (slika 6B). Doista, ekspresija MYH2 i izoformi brzih troponina (TNNC2, TNNI2 i TNNT3) bila je smanjena kod ACTA1-nemalinskih miopatija, dok je ekspresija MYH7 bila smanjena kod TNNT1-nemalinskih miopatija (Dodatna slika 11A). To je u skladu s prethodnim izvješćima o heterogenoj promjeni tipa miofibera kod nemalinskih miopatija.19,20 Potvrdili smo ove rezultate imunohistokemijom i otkrili da su pacijenti s ACTA1-nemalinskom miopatijom imali predominaciju miofibera tipa 1, dok su pacijenti s TNNT1-nemalinskom miopatijom imali suprotan obrazac (Slika 6A).
Na razini proteoma pojedinačnih vlakana, vlakna skeletnih mišića pacijenata s ACTA1 i TNNT1 nemalinskom miopatijom grupirala su se s većinom kontrolnih vlakana, pri čemu su vlakna TNNT1 nemalinske miopatije općenito bila najteže pogođena (Slika 6C). To je bilo posebno očito prilikom crtanja dijagrama pseudo-napuhanih vlakana pomoću analize glavnih komponenti (PCA) za svakog pacijenta, pri čemu su se pacijenti s TNNT1 nemalinskom miopatijom 2 i 3 činili najudaljenijima od kontrolnih uzoraka (Dodatna slika 11B, Dopunski skup podataka 20). Kako bismo bolje razumjeli kako se vlakna pacijenata s miopatijom uspoređuju sa zdravim vlaknima, koristili smo detaljne informacije dobivene proteomskom analizom 1000 vlakana od zdravih odraslih sudionika. Projicirali smo vlakna iz skupa podataka o miopatiji (pacijenti s ACTA1 i TNNT1 nemalinskom miopatijom i kontrolna skupina) na PCA dijagram dobiven proteomskom analizom 1000 vlakana (Slika 6D). Raspodjela tipova MYH vlakana duž PC2 u kontrolnim vlaknima bila je slična raspodjeli vlakana dobivenoj proteomskom analizom 1000 vlakana. Međutim, većina vlakana kod pacijenata s nemalinskom miopatijom pomaknula se niz PC2, preklapajući se sa zdravim brzotrzajnim vlaknima, bez obzira na njihov izvorni tip MYH vlakana. Dakle, iako su pacijenti s ACTA1 nemalinskom miopatijom pokazali pomak prema vlaknima tipa 1 kada su kvantificirani pomoću MYH-baziranih metoda, i ACTA1 nemalinska miopatija i TNNT1 nemalinska miopatija pomaknule su proteom vlakana skeletnih mišića prema brzotrzajnim vlaknima.
Zatim smo izravno usporedili svaku skupinu pacijenata sa zdravim kontrolama i identificirali 256 i 552 različito eksprimirana proteina u ACTA1 i TNNT1 nemalinskim miopatijama (Slika 6E–G i Dopunska slika 11C, Dopunski skup podataka 21). Analiza obogaćivanja gena otkrila je koordinirano smanjenje mitohondrijskih proteina (Slika 6H–I, Dopunski skup podataka 22). Iznenađujuće, unatoč različitoj prevlasti tipova vlakana u ACTA1 i TNNT1 nemalinskim miopatijama, ovo smanjenje bilo je potpuno neovisno o tipu vlakana temeljenom na MYH (Slika 6H i Dopunske slike 11D–I, Dopunski skup podataka 23). Tri mikrobna proteina također su bila regulirana u ACTA1 ili TNNT1 nemalinskim miopatijama. Dva od ovih mikroproteina, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (također poznat kao LINC00598 ili Lnc-FOXO1) i ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), pokazali su različitu zastupljenost samo u miofibrima tipa 1. Prethodno je objavljeno da ENSG00000215483_TR14_ORF67 igra ulogu u regulaciji staničnog ciklusa.56 S druge strane, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (koji odgovara LINC01798) bio je povećan u miofibrima i tipa 1 i tipa 2A kod ACTA1-nemalinske miopatije u usporedbi sa zdravim kontrolama (Dodatna slika 12A, Dopunski skup podataka 24). Nasuprot tome, ribosomski proteini uglavnom nisu bili pogođeni nemalinskom miopatijom, iako je RPS17 bio smanjen kod ACTA1 nemalinske miopatije (slika 6E).
Analiza obogaćivanja također je otkrila pojačanu regulaciju procesa imunološkog sustava kod ACTA1 i TNNT1 nemalinskih miopatija, dok je stanična adhezija također bila povećana kod TNNT1 nemalinske miopatije (Slika 6H). Obogaćivanje ovih izvanstaničnih faktora odrazilo se pomicanjem izvanstaničnih proteina matriksa PCA u PC1 i PC2 u negativnom smjeru (tj. prema najviše pogođenim vlaknima) (Slika 6J). Obje skupine pacijenata pokazale su povećanu ekspresiju izvanstaničnih proteina uključenih u imunološke odgovore i mehanizme popravka sarkoleme, poput aneksina (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 i njihovog interagirajućeg proteina S100A1159 (Dodatne slike 12B–C). Prethodno je objavljeno da je ovaj proces pojačan kod mišićnih distrofija60, ali, koliko znamo, prethodno nije bio povezan s nemalinskim miopatijama. Normalna funkcija ovog molekularnog mehanizma potrebna je za popravak sarkoleme nakon ozljede i za fuziju novostvorenih miocita s miofiberima58,61. Dakle, povećana aktivnost ovog procesa u obje skupine pacijenata sugerira reparativni odgovor na ozljedu uzrokovanu nestabilnošću miofibera.
Učinci svake nemalinske miopatije bili su dobro korelirani (r = 0,736) i pokazali su razumno preklapanje (Dopunske slike 11A–B), što ukazuje na to da ACTA1 i TNNT1 nemalinska miopatija imaju slične učinke na proteom. Međutim, neki proteini bili su regulirani samo u ACTA1 ili TNNT1 nemalinskoj miopatiji (Dopunske slike 11A i C). Profibrotski protein MFAP4 bio je jedan od najreguliranijih proteina u TNNT1 nemalinskoj miopatiji, ali je ostao nepromijenjen u ACTA1 nemalinskoj miopatiji. SKIC8, komponenta PAF1C kompleksa odgovorna za regulaciju transkripcije HOX gena, bila je smanjena u TNNT1 nemalinskoj miopatiji, ali nije bila pogođena u ACTA1 nemalinskoj miopatiji (Dopunska slika 11A). Izravna usporedba ACTA1 i TNNT1 nemalinske miopatije otkrila je veće smanjenje mitohondrijskih proteina i povećanje proteina imunološkog sustava kod TNNT1 nemalinske miopatije (slika 6G–H i dodatne slike 11C i 11H–I). Ovi podaci su u skladu s većom atrofijom/distrofijom uočenom kod TNNT1 nemalinske miopatije u usporedbi s TNNT1 nemalinskom miopatijom (slika 6A), što sugerira da TNNT1 nemalinska miopatija predstavlja teži oblik bolesti.
Kako bismo procijenili jesu li uočeni učinci nemalinske miopatije trajni na razini cijelog mišića, proveli smo skupnu proteomsku analizu mišićnih biopsija iste kohorte pacijenata s TNNT1 nemalinskom miopatijom i usporedili ih s kontrolnom skupinom (n=3 po skupini) (Dodatna slika 13A, Dopunski skup podataka 25). Kao što se i očekivalo, kontrolne skupine bile su usko povezane u analizi glavnih komponenti, dok su pacijenti s TNNT1 nemalinskom miopatijom pokazali veću varijabilnost među uzorcima sličnu onoj uočenoj u analizi pojedinačnih vlakana (Dopunska slika 13B). Skupna analiza reproducirala je različito eksprimirane proteine (Dopunska slika 13C, Dopunski skup podataka 26) i biološke procese (Dopunska slika 13D, Dopunski skup podataka 27) istaknute usporedbom pojedinačnih vlakana, ali je izgubila sposobnost razlikovanja različitih tipova vlakana i nije uspjela uzeti u obzir heterogene učinke bolesti na vlaknima.
Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da proteomika pojedinačnih miofibrila može razjasniti kliničke biološke značajke koje se ne mogu otkriti ciljanim metodama poput imunoblottinga. Štoviše, ovi podaci ističu ograničenja korištenja samo tipizacije aktinskih vlakana (MYH) za opis fenotipske prilagodbe. Doista, iako se promjena tipa vlakana razlikuje između aktinskih i troponin nemalinskih miopatija, obje nemalinske miopatije odvajaju tipizaciju MYH vlakana od metabolizma skeletnih mišićnih vlakana prema bržem i manje oksidativnom mišićnom proteomu.
Stanična heterogenost je ključna kako bi tkiva zadovoljila svoje raznolike potrebe. U skeletnim mišićima to se često opisuje kao tipovi vlakana karakterizirani različitim stupnjevima proizvodnje sile i zamora. Međutim, jasno je da to objašnjava samo mali dio varijabilnosti vlakana skeletnih mišića, koja je mnogo varijabilnija, složenija i višestruka nego što se prije mislilo. Tehnološki napredak sada je bacio svjetlo na čimbenike koji reguliraju vlakna skeletnih mišića. Doista, naši podaci sugeriraju da vlakna tipa 2X možda nisu zaseban podtip vlakana skeletnih mišića. Štoviše, identificirali smo metaboličke proteine, ribosomske proteine i proteine povezane sa stanicama kao glavne odrednice heterogenosti vlakana skeletnih mišića. Primjenom našeg proteomskog tijeka rada na uzorke pacijenata s miopatijom nematoda, dodatno smo pokazali da tipizacija vlakana temeljena na MYH-u ne odražava u potpunosti heterogenost skeletnih mišića, posebno kada je sustav poremećen. Doista, bez obzira na tip vlakana temeljen na MYH-u, miopatija nematoda rezultira pomakom prema bržim i manje oksidativnim vlaknima.
Vlakna skeletnih mišića klasificiraju se od 19. stoljeća. Nedavne omics analize omogućile su nam da počnemo razumijevati profile ekspresije različitih tipova MYH vlakana i njihove odgovore na različite podražaje. Kao što je ovdje opisano, omics pristupi također imaju prednost veće osjetljivosti za kvantificiranje markera tipa vlakana u odnosu na tradicionalne metode temeljene na antitijelima, bez oslanjanja na kvantifikaciju jednog (ili nekoliko) markera za definiranje tipa vlakna skeletnih mišića. Koristili smo komplementarne transkriptomske i proteomske tijekove rada i integrirali rezultate kako bismo ispitali transkripcijsku i posttranskripcijsku regulaciju heterogenosti vlakana u vlaknima ljudskih skeletnih mišića. Ovaj tijek rada rezultirao je neuspjehom u identificiranju čistih vlakana tipa 2X na razini proteina u vastus lateralisu naše kohorte zdravih mladih muškaraca. To je u skladu s prethodnim studijama pojedinačnih vlakana koje su pronašle <1% čistih 2X vlakana u zdravom vastus lateralisu, iako bi to trebalo biti potvrđeno u drugim mišićima u budućnosti. Razlika između detekcije gotovo čistih 2X vlakana na razini mRNA i samo miješanih 2A/2X vlakana na razini proteina je zbunjujuća. Ekspresija mRNA izoforme MYH nije cirkadijalna,67 što sugerira da je malo vjerojatno da smo „propustili“ signal početka MYH2 u naizgled čistim 2X vlaknima na razini RNA. Jedno moguće objašnjenje, iako čisto hipotetsko, mogle bi biti razlike u stabilnosti proteina i/ili mRNA između MYH izoformi. Doista, nijedno brzo vlakno nije 100% čisto za bilo koju MYH izoformu, i nije jasno bi li razine ekspresije mRNA MYH1 u rasponu od 70-90% rezultirale jednakom količinom MYH1 i MYH2 na razini proteina. Međutim, kada se razmatra cijeli transkriptom ili proteom, klaster analiza može s pouzdanjem identificirati samo dva različita klastera koji predstavljaju spora i brza vlakna skeletnih mišića, bez obzira na njihov precizan sastav MYH. To je u skladu s analizama koje koriste transkriptomske pristupe s jednom jezgrom, koji obično identificiraju samo dva različita mionuklearna klastera. 68, 69, 70 Nadalje, iako su prethodne proteomske studije identificirale vlakna tipa 2X, ta se vlakna ne grupiraju odvojeno od ostatka brzih vlakana i pokazuju samo mali broj različito obilnih proteina u usporedbi s drugim tipovima vlakana na temelju MYH-a. 14 Ovi rezultati sugeriraju da bismo se trebali vratiti na pogled na klasifikaciju mišićnih vlakana s početka 20. stoljeća, koji je dijelio ljudska skeletna mišićna vlakna ne u tri različite klase na temelju MYH-a, već u dva klastera na temelju njihovih metaboličkih i kontraktilnih svojstava. 63
Što je još važnije, heterogenost miofibera treba promatrati u više dimenzija. Prethodne „omics“ studije ukazale su u tom smjeru, sugerirajući da vlakna skeletnih mišića ne tvore zasebne nakupine, već su raspoređena duž kontinuuma. 11, 13, 14, 64, 71 Ovdje pokazujemo da se, osim razlika u kontraktilnim i metaboličkim svojstvima skeletnih mišića, miofiberi mogu razlikovati prema značajkama povezanim s interakcijama stanica i mehanizmima translacije. Doista, pronašli smo heterogenost ribosoma u vlaknima skeletnih mišića koja doprinosi heterogenosti neovisno o sporim i brzim tipovima vlakana. Temeljni uzrok ove značajne heterogenosti miofibera, neovisno o sporim i brzim tipovima vlakana, ostaje nejasan, ali može ukazivati na specijaliziranu prostornu organizaciju unutar mišićnih snopića koja optimalno reagira na specifične sile i opterećenja,72 specijaliziranu staničnu ili organ-specifičnu komunikaciju s drugim tipovima stanica u mišićnom mikrookruženju73,74,75 ili razlike u aktivnosti ribosoma unutar pojedinačnih miofibera. Doista, pokazalo se da je ribosomska heteroplazmija, bilo putem paralogne supstitucije RPL3 i RPL3L ili na razini 2'O-metilacije rRNA, povezana s hipertrofijom skeletnih mišića76,77. Multi-omske i prostorne primjene u kombinaciji s funkcionalnom karakterizacijom pojedinačnih miofibera dodatno će unaprijediti naše razumijevanje mišićne biologije na multi-omskoj razini78.
Analizirajući proteome pojedinačnih miofibera kod pacijenata s nemalinskim miopatijama, također smo pokazali korisnost, učinkovitost i primjenjivost proteomike pojedinačnih miofibera za razjašnjavanje kliničke patofiziologije skeletnih mišića. Štoviše, usporedbom našeg tijeka rada s globalnom proteomskom analizom, uspjeli smo pokazati da proteomika pojedinačnih miofibera daje istu dubinu informacija kao i globalna proteomika tkiva te proširuje tu dubinu uzimajući u obzir heterogenost među vlaknima i tip miofibera. Uz očekivane (iako varijabilne) razlike u omjeru tipova vlakana uočene kod ACTA1 i TNNT1 nemalinskih miopatija u usporedbi sa zdravim kontrolama,19 također smo primijetili oksidativno i izvanstanično preoblikovanje neovisno o promjeni tipova vlakana posredovanoj MYH-om. Fibroza je prethodno zabilježena kod TNNT1 nemalinskih miopatija.19 Međutim, naša analiza se nadovezuje na ovaj nalaz otkrivajući i povećane razine izvanstaničnih izlučenih proteina povezanih sa stresom, poput aneksina, uključenih u mehanizme popravka sarkoleme, u miofibrama pacijenata s ACTA1 i TNNT1 nemalinskim miopatijama.57,58,59 Zaključno, povećane razine aneksina u miofibrama pacijenata s nemalinskom miopatijom mogu predstavljati stanični odgovor na popravak teško atrofičnih miofibrala.
Iako ova studija predstavlja do sada najveću analizu omike cijelog mišića kod ljudi na pojedinačnim vlaknima, ona nije bez ograničenja. Izolirali smo vlakna skeletnih mišića iz relativno malog i homogenog uzorka sudionika i jednog mišića (vastus lateralis). Stoga je nemoguće isključiti postojanje specifičnih populacija vlakana u različitim tipovima mišića i na ekstremnim razinama mišićne fiziologije. Na primjer, ne možemo isključiti mogućnost pojave podskupa ultrabrzih vlakana (npr. čista 2X vlakna) kod visoko treniranih sprintera i/ili sportaša snage79 ili tijekom razdoblja mišićne neaktivnosti66,80. Nadalje, ograničena veličina uzorka sudionika spriječila nas je u istraživanju spolnih razlika u heterogenosti vlakana, budući da je poznato da se omjeri tipova vlakana razlikuju između muškaraca i žena. Nadalje, nismo bili u mogućnosti provesti transkriptomske i proteomske analize na istim mišićnim vlaknima ili uzorcima od istih sudionika. Kako mi i drugi nastavljamo optimizirati analize pojedinačnih stanica i pojedinačnih miofibrila koristeći omics analizu kako bismo postigli ultra-nizak ulaz uzorka (kao što je ovdje prikazano u analizi vlakana pacijenata s mitohondrijskom miopatijom), postaje očita mogućnost kombiniranja multi-omics (i funkcionalnih) pristupa unutar pojedinačnih mišićnih vlakana.
Sveukupno, naši podaci identificiraju i objašnjavaju transkripcijske i posttranskripcijske pokretače heterogenosti skeletnih mišića. Točnije, predstavljamo podatke koji osporavaju dugogodišnju dogmu u fiziologiji skeletnih mišića povezanu s klasičnom definicijom tipova vlakana temeljenom na MYH-u. Nadamo se da ćemo obnoviti raspravu i u konačnici preispitati naše razumijevanje klasifikacije i heterogenosti vlakana skeletnih mišića.
Četrnaest bijelih sudionika (12 muškaraca i 2 žene) dobrovoljno je pristalo sudjelovati u ovoj studiji. Studiju je odobrio Etički odbor Sveučilišne bolnice u Ghentu (BC-10237), bila je u skladu s Helsinškom deklaracijom iz 2013. i registrirana je na ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Opće karakteristike sudionika prikazane su u Dodatnoj tablici 1. Nakon dobivanja usmenog i pisanog informiranog pristanka, sudionici su podvrgnuti liječničkom pregledu prije konačnog uključivanja u studiju. Sudionici su bili mladi (22–42 godine), zdravi (bez zdravstvenih problema, bez povijesti pušenja) i umjereno fizički aktivni. Maksimalni unos kisika određen je pomoću step ergometra za procjenu tjelesne spremnosti kao što je prethodno opisano. 81
Uzorci biopsije mišića prikupljeni su u mirovanju i natašte tri puta, u razmaku od 14 dana. Budući da su ovi uzorci prikupljeni kao dio veće studije, sudionici su konzumirali placebo (laktozu), antagonist H1-receptora (540 mg feksofenadina) ili antagonist H2-receptora (40 mg famotidina) 40 minuta prije biopsije. Prethodno smo pokazali da ovi antagonisti histaminskih receptora ne utječu na kondiciju skeletnih mišića u mirovanju81, a u našim dijagramima kontrole kvalitete nije uočeno grupiranje povezano sa stanjem (Dodatne slike 3 i 6). Standardizirana prehrana (41,4 kcal/kg tjelesne težine, 5,1 g/kg tjelesne težine ugljikohidrata, 1,4 g/kg tjelesne težine proteina i 1,6 g/kg tjelesne težine masti) održavana je 48 sati prije svakog eksperimentalnog dana, a standardizirani doručak (1,5 g/kg tjelesne težine ugljikohidrata) konzumiran je ujutro eksperimentalnog dana. Pod lokalnom anestezijom (0,5 ml 1% lidokaina bez adrenalina), biopsije mišića dobivene su iz mišića vastus lateralis perkutanom Bergströmovom aspiracijom.82 Uzorci mišića odmah su ugrađeni u RNAlater i pohranjeni na 4°C do ručne disekcije vlakana (do 3 dana).
Svježe izolirani snopovi miofibera preneseni su u svježi RNAlater medij u zdjelici za kulturu. Pojedinačna miofibera zatim su ručno secirana pomoću stereomikroskopa i fine pincete. Iz svake biopsije secirano je dvadeset pet vlakana, s posebnom pažnjom na odabir vlakana iz različitih područja biopsije. Nakon disekcije, svako vlakno je nježno uronjeno u 3 μl pufera za lizu (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) koji sadrži proteinazu K i enzime DNase kako bi se uklonili neželjeni proteini i DNA. Liza stanica i uklanjanje proteina/DNA zatim su započeti kratkim vrtloženjem, vrtnjom tekućine u mikrocentrifugi i inkubacijom na sobnoj temperaturi (10 min). Lizat je zatim inkubiran u termocikleru (T100, Bio-Rad) na 37°C tijekom 5 minuta, 75°C tijekom 5 minuta, a zatim odmah pohranjen na -80°C do daljnje obrade.
Illumina-kompatibilne poliadenilirane RNA biblioteke pripremljene su iz 2 µl lizata miofibera pomoću QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Detaljne metode mogu se pronaći u priručniku proizvođača. Postupak započinje sintezom cDNA prvog lanca reverznom transkripcijom, tijekom koje se uvode jedinstveni molekularni identifikatori (UMI) i i1 barkodovi specifični za uzorak kako bi se osiguralo objedinjavanje uzoraka i smanjila tehnička varijabilnost tijekom daljnje obrade. cDNA iz 96 miofibera zatim se skuplja i pročišćava magnetskim kuglicama, nakon čega se RNA uklanja i provodi sinteza drugog lanca pomoću nasumičnih primera. Biblioteka se pročišćava magnetskim kuglicama, dodaju se i5/i7 oznake specifične za bazen i PCR amplificira. Završni korak pročišćavanja proizvodi Illumina-kompatibilne biblioteke. Kvaliteta svakog bazena biblioteka procijenjena je pomoću High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Na temelju kvantifikacije Qubita, uzorci su dalje združeni pri ekvimolarnim koncentracijama (2 nM). Dobiveni uzorci su zatim sekvencirani na instrumentu NovaSeq 6000 u standardnom načinu rada korištenjem NovaSeq S2 Reagent Kita (1 × 100 nukleotida) s 2 nM učitavanja (4% PhiX).
Naš cjevovod temelji se na Lexogenovom QuantSeq Pool cjevovodu za analizu podataka (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Podaci su prvo demultipleksirani pomoću bcl2fastq2 (v2.20.0) na temelju i7/i5 indeksa. Očitavanje 2 je zatim demultipleksirano pomoću idemux (v0.1.6) na temelju i1 uzorka barkoda, a UMI sekvence su ekstrahirane pomoću umi_tools (v1.0.1). Očitavanja su zatim obrezana pomoću cutadapt (v3.4) u više rundi kako bi se uklonili kratki očitavanja (duljine <20) ili očitavanja koja se sastoje isključivo od adapterskih sekvenci. Očitavanja su zatim poravnata s ljudskim genomom pomoću STAR-a (v2.6.0c), a BAM datoteke su indeksirane pomoću SAMtools-a (v1.11). Duplikati očitavanja su uklonjeni pomoću umi_tools (v1.0.1). Konačno, brojanje poravnanja je izvršeno pomoću featureCounts u Subread-u (v2.0.3). Kontrola kvalitete provedena je korištenjem FastQC-a (v0.11.9) u nekoliko međufaza cjevovoda.
Sva daljnja bioinformatička obrada i vizualizacija provedena je u R-u (v4.2.3), prvenstveno korištenjem Seurat (v4.4.0) tijeka rada. 83 Stoga su pojedinačne UMI vrijednosti i matrice metapodataka transformirane u Seurat objekte. Geni izraženi u manje od 30% svih vlakana uklonjeni su. Uzorci niske kvalitete uklonjeni su na temelju minimalnog praga od 1000 UMI vrijednosti i 1000 detektiranih gena. Konačno, 925 vlakana prošlo je sve korake filtriranja kontrole kvalitete. UMI vrijednosti normalizirane su korištenjem Seurat SCTransform v2 metode, 84 uključujući svih 7418 detektiranih značajki, a razlike između sudionika su regresirano uklonjene. Svi relevantni metapodaci mogu se pronaći u Dodatnom skupu podataka 28.
Vrijeme objave: 10. rujna 2025.